"МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ ПОЧВЫ" (утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 19.02.81 N 2293-81) (извлечение)

Ускоренный культурально - морфологический метод установления влияния химических веществ на микроорганизмы

Сущность метода заключается в наблюдении под микроскопом с фазовым контрастом за ростом и размножением чистых культур микроорганизмов на специально приготовленных агаровых пластинках. Питательные среды, соответствующие для изучаемых видов микроорганизмов, расплавляют и разливают в стерильные пробирки по 10 мл. Расчет рабочих концентраций химических веществ производится следующим образом: не больше 1 мл раствора на 10 мл питательной среды. Одна пробирка каждой серии является контрольной - без химических соединений. После внесения химических веществ все пробирки ставят на водяную баню, для поддержания температуры в пределах 50 - 70 град. C. Чистые предметные стекла прожигают над пламенем горелки, затем на них из пробирок наносят тонкий слой (0,5 - 1 мм) питательной среды. Параллельно, на покровное стекло пастеровской пипеткой наносится небольшая капля суспензии клеток тест - микроорганизма определенной концентрации (для энтеробактерий оптимальная концентрация 200 млн./мл, для дрожжей - 50 млн./мл). Покровное стекло с нанесенной каплей бактериальной взвеси переворачивается и опускается на поверхность тонкого слоя агара. Капля под покровным стеклом растекается на всю его площадь. Результаты проведенных опытов показали, что для получения ответа на статистически достоверном уровне достаточно просмотреть один препарат при подсчете не менее 100 микроколоний и единичных клеток. Наблюдение под микроскопом производится после инкубировання в термостате в течение времени, необходимого для каждого вида микроорганизмов и охлаждения их в холодильнике при температуре 6 - 10 град. C в течение 10 - 15 мин. Из термостата вынимают все слайды (опытные и контрольные) одновременно. Просмотр проводят по диагонали препарата с увеличением 40x7. При таком увеличении в поле зрения попадает 20 - 25 клеток, которые легко поддаются учету.

Разработаны критерии учета антибактериальных свойств химических веществ. К ним относятся: 1) процент жизнеспособных клеток; 2) интенсивность размножения - показывающая, с какой скоростью делится популяция за определенный промежуток времени; 3) длительность лаг - фазы; 4) морфологические изменения отдельных клеток и микроколоний.

Показатель жизнеспособности - это удельный вес размножившихся клеток микроорганизмов опытных серий (с токсическими соединениями) по сравнению с контролем в аналогичных условиях без внесения изучаемого соединения. Для получения результатов с точностью на уровне 96% необходимо в каждом препарате просмотреть не менее 400 микроколоний и единичных клеток. Время инкубации определяется опытным путем для каждого вида микроорганизмов. Для ряда видов микроорганизмов время инкубации установлено, а именно: для микроорганизмов кишечной группы - 3 часа; Cl. perfringens - 4 часа; Micrococcus - 3,5 - 5 часов; Rh. gracilis - 7 часов.

Целесообразно, на основании показателя жизнеспособности, определять процент ингибирования, который высчитывается вычитанием от 100 процента жизнеспособности.

Интенсивность размножения является вторым важным показателем влияния токсических соединений на микроорганизмы и определяется следующим образом. После определения первого показателя (жизнеспособность или процент ингибиции) в нескольких полях зрения подсчитывается общее количество клеток во всех микроколониях контрольных и опытных препаратов. Подсчету подлежат и отдельные неразмножавшиеся клетки. Общее количество подсчитываемых отдельных клеток и микроколоний должно быть не менее 100. После, на основании получаемых величин, высчитывается степень подавления или стимуляции выражаемой в процентах по сравнению с контролем. Для этого в контроле и опытных препаратах определяется среднее количество клеток в одной микроколонии. Среднее количество клеток в микроколониях контрольного препарата принимается за 100%.

Одновременно, без дополнительных опытов, на тех же препаратах, можно определить и другой показатель - морфологические изменения микроорганизмов под действием токсических веществ и соединений. В контрольных препаратах отдельные клетки и клетки в микроколониях располагаются в определенном, характерном для каждого вида, порядке, в одной полости, имеют четкое очертание. При выращивании тест - микроорганизмов на питательных средах, содержащих токсическое соединение, наблюдаются морфологические изменения как отдельных клеток, так и микроколоний.

Культурально - морфологическим методом определяется еще один показатель антибактериального действия химических веществ на микроорганизмы - лаг - фаза. Для определения длительности лаг - фазы готовится не один, а несколько препаратов (5 - 6 и более) контроля в каждой концентрации изучаемого химического соединения. Это необходимо для того, чтобы просмотреть контрольный и опытные препараты в динамике - через определенные промежутки времени инкубации. Для этого, с учетом лаг - фазы каждого вида микроорганизма, определяют периодичность просмотра препаратов. Например, если лаг - фаза микроорганизмов находится в пределах 1 часа, то целесообразно препараты просматривать каждые 10 - 15 минут, если 2 - 3 часа и более - каждые 30 минут или 1 час. Общее время наблюдения не должно превышать срок наблюдения при определении первого показателя - жизнеспособности.

Длительность лаг - фазы равна времени от начала инкубации до появления 1 - 3 микроколоний, состоящих из 4 и более клеток и выражается в часах и минутах. Общим требованием, при определении этого показателя, является просмотр всех препаратов (контрольных и опытных) через равные промежутки времени. Для этого, если невозможно их учесть в течение нескольких минут, препараты помещают в холодильник, чтобы прекратить размножение популяции микроорганизмов.

Результаты выражаются в абсолютных (время лаг - фазы в минутах) или относительных (процент удлинения или сокращения лаг - фазы микроорганизмов под действием токсических веществ по сравнению с контролем) показателях.