"МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ В РЫБЕ, НЕРЫБНЫХ ОБЪЕКТАХ ПРОМЫСЛА, ПРОДУКТАХ, ВЫРАБАТЫВАЕМЫХ ИЗ НИХ, ВОДЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ И ДРУГИХ ОБЪЕКТАХ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2046-06" (утв. Роспотребнадзором 30.01.2006)

5.1. Исследование пищевых продуктов

Порядок исследования и содержание работы по этапам схематически представлены на рис. 1.

Рис. 1

СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ НА ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ ВИБРИОНЫ

Обозначения: п.в. - пептонная вода; ПУС - полиуглеводная среда; ЩА - щелочной агар; ЭС - элективная среда.

При количественном анализе из разведений пробы 1:10, 1:100 и 1:1000 высевают по 0,1 мл на 2 чашки с элективной агаровой средой, например: питательной средой элективно-дифференциальной для выделения холерного вибриона сухой - СЭДХ - ВФС 42-411 ВС-93, селективной средой для выделения патогенных вибрионов - TCBS или дифференциально-диагностический агар с пенициллином - ДДА (п. 7.2.1.6.). Посевной материал распределяют по поверхности агара и дают подсохнуть. Посевы помещают в термостат при (37 +/- 0,5) °С на 18 - 24 ч.

При качественном анализе посевы в накопительные среды инкубируют при (37 +/- 0,5) °С в течение 18 - 20 ч, после чего делают высев петлей с поверхностного слоя обогатительной среды на 1 - 2 чашки элективной среды для получения роста в виде изолированных колоний.

5.1.1. Отбор колоний и идентификация выделенных культур

Изучают рост на элективных средах, отбирают подозрительные на парагемолитические вибрионы колонии. При количественном анализе для подсчета отбирают чашки с посевом двух последовательных разведений, где выросло не более 300 колоний. Необходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 15 колоний. С каждой из 4-х отобранных для подсчета чашек отсевают по 5 колоний. Парагемолитические вибрионы на элективной среде формируют колонии правильной округлой формы, плосковыпуклые, полупрозрачные в проходящем свете, с влажной блестящей поверхностью, размером 2 - 3 мм в диаметре, не отличающиеся по цвету от голубовато-зеленого цвета элективных сред (СЭДХ, TCBS, ДДА), т.к. вибрионы этого вида не ферментируют сахарозу, входящую в них. Подозрительные колонии отсевают на щелочной агар - питательную среду для выделения и культивирования холерного вибриона, сухую (ФС 42-213 ВС-88) и на одну из полиуглеводных сред Ресселя (п. 7.2.1.7), Клиглера (ФС 42-3387-97) или другие с аналогичными характеристиками, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке.

На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичным для парагемолитических вибрионов ростом. На среде Ресселя и Клиглера отмечают характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части агара.

Культуры, выросшие на щелочном агаре, изучают на наличие цитохромоксидазы. Из оксидазопозитивных готовят мазки по Граму.

Для дальнейшей идентификации отбирают оксидазопозитивные грамотрицательные культуры с характерным ростом на полиуглеводных средах. Отобранные культуры изучают по набору признаков (подвижность, лизиндекарбоксилаза, аргининдигидролаза, индол, рост в средах с различными концентрациями натрия хлорида, ферментация/окисление глюкозы на среде Хью и Лейфсона (п. 7.2.1.8), арабинозы, сахарозы, целлобиозы, салицина, реакция Фогес-Проскауэра), методами, описанными в разделе 6 и методических указаниях МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры".

При расследовании случаев заболевания, обусловленных V. раrаhaemolyticus, выделенные культуры изучают по расширенному набору признаков, приведенному в табл. 1, а также по тестам внутривидовой дифференциации: серотипированию и феномену Канагава.

Таблица 1

СВОЙСТВА ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ И СХОДНЫХ С НИМИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Условные обозначения:

+ положительный результат в 90%;

- отрицательный результат в 90%;

+/- признак вариабелен;

+(-) или -(+) в скобках - редко наблюдаемый результат;

* - V. anguillarum реклассифицирован в Listonella anguillarum (Mcc Donell M.T., Colwell R.R., 1985), является возбудителем инфекционного заболевания рыб и других гидробионтов, обитающих в соленых и реже - в пресных водоемах. Роль в патологии человека микроорганизмов этого вида не установлена;

О/Ф тест окисления/ферментации глюкозы в среде Хью-Лейфсона.

5.1.2. Обработка результатов

Количество парагемолитических вибрионов в 1 г продукта (N) в соответствии с ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований" подсчитывают по формуле:

где:

SUM а - сумма парагемолитических вибрионов, рассчитанная по формуле:

где:

а - количество вибрионов для каждой чашки;

b - количество колоний, микроорганизмы которых идентифицированы как V. parahaemolyticus;

А - количество колоний, отобранных для идентификации;

С - общее число выросших на чашке колоний;

V - объем посевного материала, внесенного в каждую чашку, куб. см;

n1 - количество отобранных для подсчета чашек в первом разведении;

n2 - количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении;

d - коэффициент разбавления, соответствующий первому разведению.

Если в каждой из двух чашек, отобранных для подсчета колоний, содержится их менее 15, то приближенное количество микроорганизмов в 1 г продукта (N_E) рассчитывают по формуле:

где:

гамма - среднее арифметическое колоний, подсчитанных в указанных двух чашках;

d - коэффициент разбавления исходной суспензии.

Если две чашки не содержат колоний на уровне исходной суспензии, то результаты выражают следующим образом:

- менее 1/d микроорганизмов в 1 г, где d - коэффициент разбавления исходной суспензии.

Доверительный интервал, характеризующий статистическое распределение микроорганизмов в пробе, рассчитывают в соответствии с ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований".