"МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ В РЫБЕ, НЕРЫБНЫХ ОБЪЕКТАХ ПРОМЫСЛА, ПРОДУКТАХ, ВЫРАБАТЫВАЕМЫХ ИЗ НИХ, ВОДЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ И ДРУГИХ ОБЪЕКТАХ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2046-06" (утв. Роспотребнадзором 30.01.2006)
6. Методы изучения свойств парагемолитических вибрионов
6.1. Определение подвижности
Подвижность определяют при микроскопировании раздавленной капли с помощью фазово-контрастного устройства или посевом в 0,3%-й агар, приготовленный из мясопептонного агара (МПА) с 3% натрия хлорида (п. 7.2.1.5).
6.2. Определение цитохромоксидазыПервый способ.
Для постановки пробы можно использовать бумажки из наборов систем индикаторных бумажных для идентификации микроорганизмов (набор N 1 для вибрионов; набор N 2 для межродовой дифференциации энтеробактерий) - СИБ (ФС 42-3566-98) или пропитать полоску фильтровальной бумаги 2 - 3 каплями однокомпонентного 1%-го реактива или смесью 1%-го раствора реактива с альфа-нафтолом в соотношении 2:3. На обработанную реактивом полоску бумаги наносят платиновой петлей, деревянной или стеклянной палочкой исследуемую культуру. При появлении красного или синего окрашивания через 30 - 60 с реакцию считают положительной.
Второй способ.
На поверхность колонии 18 - 24-часовой культуры, выросшей на щелочном агаре, наносят каплю однокомпонентного реактива. Положительная реакция - красная окраска - появляется через 20 - 30 с. При использовании двухкомпонентной реакции (с альфа-нафтолом) в положительных случаях появляется синее окрашивание культуры. Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на цитохромоксидазу дают вибрионы, аэромонады, плезиомонады, а отрицательную - энтеробактерии.
6.3. Определение галофильности и солевой толерантностиСуточную агаровую культуру засевают в 1%-ю пептонную воду с 1% натрия хлорида (п. 7.2.1.3). Через 3 - 4 ч инкубации при температуре (37 +/- 0,5) °С переносят строго по 1 капле выросшей культуры в пептонную воду без соли и с 3, 6, 8 и 10% натрия хлорида. Через 18 - 20 ч инкубации оценивают рост по помутнению среды.
Пептонную воду готовят из сухих компонентов без натрия хлорида и с внесением в нее необходимой навески соли.
Негалофильные вибрионы растут в отсутствии соли в среде. Галофильные вибрионы не растут в 1%-й пептонной воде без добавления натрия хлорида и устойчивы к различным его концентрациям.
6.4. Выявление способности к роениюНа пластинке МПА с 3% натрия хлорида (п. 7.2.1.5) алгинолитические вибрионы, в отличие от большинства штаммов парагемолитических, растут в виде сплошного налета, напоминающего рост вульгарного протея. Для выявления феномена роения суточную агаровую культуру наносят в центр подсушенной пластины щелочного агара и сутки инкубируют при (37 +/- 0,5) °С. Роящиеся культуры распространяются по поверхности всей среды, а нероящиеся - вырастают только на месте посева.
6.5. Биохимические тестыТип расщепления глюкозы, декарбоксилазную активность, ферментацию углеводов и спиртов, гидролиз мочевины, образование индола, сероводорода определяют с использованием общепринятых питательных сред, содержащих 1,5% натрия хлорида.
6.6. Определение бета-галактозидазыСуточную агаровую культуру засевают на скошенную поверхность агара, содержащего 10% лактозы. Посевы инкубируют 1 - 2 суток при температуре (37 +/- 0,5) °С. Петлю культуры суспендируют в 0,25 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида, добавляют 0,25 мл водного раствора ортонитрофенил-бета-D-галактопиранозида (ONPG) и помещают в термостат при (37 +/- 0,5) °С. Для приготовления раствора ONPG 80 мг вещества растворяют в 15 мл дистиллированной воды при 37 °С. Затем добавляют 5 мл фосфатного буфера и доводят рН до 7,0. Раствор должен быть бесцветным. Хранят его при 4 °С. Перед использованием выдерживают несколько минут при 37 °С до растворения фосфата, который на холоде кристаллизуется. Реакцию учитывают через 20 мин., 1, 3 и 24 ч. В положительном случае взвесь приобретает желтую окраску, отрицательном - остается бесцветной.
6.7. Постановка реакции Фогес-ПроскауэраКультуру засевают в глюкозофосфатный бульон Кларка (ВФС 42-46 ВС-86) и инкубируют при температуре (37 +/- 0,5) °С в течение 1 - 3 суток. Затем к 1 мл культуры добавляют 0,6 мл 6%-го спиртового раствора альфа-нафтола и 0,4 мл 40%-го раствора едкого калия. Пробирки встряхивают и помещают на 1 ч в термостат. При положительной реакции среда окрашивается в розовый или красный цвет.
6.8. Определение нитратредуктазыа) Суточную агаровую культуру засевают в 1 мл бульона Хоттингера с 0,1% калия азотнокислого. После 2-х суток инкубации при температуре (37 +/- 0,5) °С в посевы добавляют 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях среда сразу же окрашивается в красный цвет.
б) К 1 - 2-суточной культуре в бульоне Хоттингера с 0,1% KNO3 добавляют 3 - 5 капель реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1%-го раствора риванола в дистиллированной воде и 12%-го раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции бульон окрашивается в красный цвет.
6.9. Серологическое типирование парагемолитических вибрионовВ основу серологической классификации парагемолитических вибрионов положены различия в строении О- и К-антигенов. Известно 12 типов термостабильного О-антигена и 68 - термолабильного К-антигена. Каждый К-антиген сочетается с одним и тем же О-антигеном, образуя ту или иную серогруппу (табл. 2).
Таблица 2
СХЕМА СЕРОТИПИРОВАНИЯ V. PARAHAEMOLYTICUS (SAKAZAKI R., 1979)
* - К-антигены, принадлежащие к двум О-серогруппам.
Используют наборы агглютинирующих О- и К-сывороток для серологического типирования на стекле, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке (например, Toschiba Kazaki Co. Ltd и др.). Для определения К-антигена исследуют суточную агаровую живую культуру, О-антигена - убитую двухчасовым кипячением.
Групповые заболевания чаще обусловливают парагемолитические вибрионы серогрупп O4:К12, O4:К8, O3:К6, спорадические - O3:К33, O3:К57, O5:К47, O6:К46, O10:К52.
6.10. Определение патогенных свойств парагемолитических вибрионовСуточную бульонную культуру наносят каплей на пластину свежеприготовленной среды Вагатцума. Посевы инкубируют при (37 +/- 0,5) °С 24 - 48 ч. Результат учитывают по величине и полноте зоны гемолиза. Штаммы оценивают как Канагава-позитивные, если зона четкого лизиса достигает 3-х и более миллиметров, считая от края колонии до наружного края зоны. При зоне менее 3 мм результат оценивают как слабо положительный.