"МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ В РЫБЕ, НЕРЫБНЫХ ОБЪЕКТАХ ПРОМЫСЛА, ПРОДУКТАХ, ВЫРАБАТЫВАЕМЫХ ИЗ НИХ, ВОДЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ И ДРУГИХ ОБЪЕКТАХ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2046-06" (утв. Роспотребнадзором 30.01.2006)
7. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, питательные среды и тест-штаммы
7.1. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда
Перечень аппаратуры, оборудования лаборатории и требования к ним представлены в ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Продукты пищевые. Общие правила микробиологического исследования".
7.2. Питательные среды и тест-системы для выделения и идентификации парагемолитических вибрионов7.2.1.1. Фосфатный буферный раствор для подготовки проб к исследованию, 0,1 М, рН 7,4 - 7,5 (PBS).
Двузамещенный фосфорнокислый натрий Na2HPO4 (безводный) - 12,0 г.
Однозамещенный фосфорнокислый натрий NaH2PO4 x Н2О - 2,2 г.
Натрия хлорид - 85,0 г.
Дистиллированная вода - 1,0 л.
Способ приготовления. Растворить ингредиенты в малом объеме дистиллированной воды в колбе. После растворения довести объем дистиллированной водой до 1,0 литра. Перед использованием развести бидистиллированной водой 1:10. В случае необходимости довести рН до 7,4 - 7,5 с помощью 0,1 н НСl или 0,1 н NaOH. Стерилизовать 15 мин. при 121 °С.
7.2.1.2. Раствор 0,1%-й пептонной воды с 3% натрия хлорида (для подготовки проб к исследованию).
Пептон ферментативный - 1,0 г.
Натрия хлорид - 30,0 г.
Ингредиенты перемешивают, подщелачивают 20%-м раствором гидроокиси натрия до рН 8,5 +/- 0,1. Варят в автоклаве текучим паром в течение 40 мин. Фильтруют через ватный фильтр. Устанавливают рН 8,0 +/- 0,2 с помощью 18%-го раствора соляной кислоты. Среду разливают в емкости и стерилизуют при температуре 112 °С в течение 20 мин.
7.2.1.3. Пептонная вода 1%-я с 3, 6, 8, 10% натрия хлорида (для определения солевой толерантности).
Пептон ферментативный - 10,0 г.
Натрия хлорид - 30,0 (80,0; 100,0) г.
Вода дистиллированная - 1,0 л.
рН 8,2 +/- 0,2.
В воду очищенную вносят пептон ферментативный и требуемую навеску натрия хлорида. Подщелачивают 20%-м раствором гидроокиси натрия до рН 8,6 +/- 0,1. Варят текучим паром в автоклаве 40 мин. или кипятят до растворения ингредиентов. Добавляют навеску калия нитрата, перемешивают, фильтруют через ватный фильтр и устанавливают рН с помощью 18%-го раствора соляной кислоты.
Среду для определения галофильности - 1%-ю пептонную воду без натрия хлорида готовят по этой прописи, но без добавления натрия хлорида. Эту среду не допускается готовить из основного раствора пептона, так как в нем уже содержится натрия хлорид.
7.2.1.4. Пептонная вода с ингибиторами (теллуритом калия или препаратом "Прогресс").
В 1%-ю пептонную воду с 3% натрия хлорида после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1:100000 или 1:200000, или же к 1%-й пептонной воде добавляют 0,1 - 0,2% моющего средства "Прогресс". Конечная концентрация ингибиторов в средах может быть изменена с учетом результатов контроля. Водный раствор натриевых солей вторичных алкилсульфатов в виде моющего вещества "Прогресс-30" или "Прогресс-40" по ТУ 38.10719-77.
7.2.1.5. Мясопептонный агар МПА с 3% натрия хлорида.
Пептон ферментативный - 10,0 г.
Натрия хлорид - 30,0 г.
Агар микробиологический (ГОСТ 17206-96) - (13,0 +/- 1,0) г.
рН 8,0 +/- 0,2.
В мясную воду вносят пептон ферментативный и натрия хлорид, перемешивают и подщелачивают 20%-м раствором гидроокиси натрия до рН 8,5 +/- 0,1. Затем добавляют агар микробиологический. Варят в автоклаве текучим паром (50 +/- 10) мин. Фильтруют через ватный фильтр. Устанавливают рН 8,0 +/- 0,2 с помощью 18%-го раствора соляной кислоты. Среду разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве при 112 °С в течение 20 мин. При необходимости в состав среды вводят 0,1 - 0,2% препарата "Прогресс" (перед автоклавированием или в стерильный агар с последующим 10-минутным кипячением). Теллурит калия добавляют к автоклавированной среде перед ее использованием в конечном разведении 1:100000 или 1:200000.
7.2.1.6. Дифференциально-диагностический агар с пенициллином ДДА.
Среда рекомендована методическими документами: "Временные методические рекомендации по контролю за содержанием парагемолитического вибриона в рыбе и рыбопродуктах. Методы исследования и нормативы" N 3933-85, утв. Зам. Главного государственного санитарного врача СССР, "Методические указания по контролю в рыбных продуктах парагемолитических вибрионов - возбудителей пищевых токсикоинфекций" N 5780-91, утв. Зам. Главного государственного санитарного врача СССР и Зам. Министра рыбного хозяйства СССР, "Временная инструкция по борьбе с вибриозом рыб" 1998 г., Министерство сельского хозяйства и продовольствия РФ, Департамент ветеринарии.
Рыбо- или мясопептонный агар 2%-й щелочной - 1 л.
Натрия хлорид - 25,0 г.
Сахароза - 15,0 г.
Пенициллин - 5000 ЕД.
Бромтимоловый синий (1,6%-й спиртовой раствор) - 10,0 мл.
Жидкость "Прогресс-30" или "Прогресс-40" - 1 - 2 мл.
Калия теллурит (1:1000) - 7,5 мл.
К стерильному расплавленному рыбо- или мясопептонному агару (рН 8,0), охлажденному до 50 °С, добавляют указанные ингредиенты и, не стерилизуя, разливают в чашки Петри. Среда имеет сине-зеленый цвет, хранят в холодильнике до 14 суток.
Парагемолитические вибрионы, не ферментирующие сахарозу, растут в виде голубоватых колоний, V. alginolyticus, V. anguillarum и V. cholerae - колоний желтого цвета. Некоторые штаммы аэромонад и псевдомонад формируют колонии желтого цвета.
К расплавленному и охлажденному до 50 - 60 °С 1,5%-му мясопептонному агару или агару Мартена рН 7,3 +/- 0,1 добавляют лактозу - 10,0 г/л, глюкозу - 1,0 г/л, индикатор Андреде - 20 - 40 мл/л (количество которого устанавливают экспериментальным путем в зависимости от качества используемого для приготовления фуксина кислого). Среду разливают в стерильные пробирки по 7 - 8 мл и стерилизуют в автоклаве при 104 °С 20 мин. После стерилизации среду скашивают так, чтобы в каждой пробирке были столбик и скошенная часть.
7.2.1.8. Среда Хью-Лейфсона.
Пептон ферментативный - 2,0 г.
Натрия хлорид - 15,0 г.
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,3 г.
Глюкоза - 10,0 г.
Бромтимоловый синий (1%-й водный раствор) - 3,0 мл.
Агар микробиологический (ГОСТ 17206-96) - 3,0 г.
Вода дистиллированная - 1,0 л.
рН после стерилизации 7,2 +/- 0,1.
К воде дистиллированной добавляют пептон ферментативный, натрия хлорид, калий фосфорнокислый двузамещенный, агар микробиологический. Подщелачивают 20%-м раствором гидроокиси натрия до рН 8,5 +/- 0,1. Доводят до кипения и кипятят до расплавления агара и растворения ингредиентов. Фильтруют через ватный фильтр. Устанавливают рН 7,4 +/- 0,1 с помощью 18%-го раствора соляной кислоты. Добавляют глюкозу и 1%-й водный раствор бромтимолового синего. Среду разливают в пробирки по 5,0 мл и стерилизуют при 112 °С 20 мин. Цвет среды после стерилизации травянисто-зеленый. При кислой реакции среда желтеет.
7.2.1.9. Среды для определения декарбоксилаз и дигидролазы аминокислот (среды Меллера).
Пептон ферментативный - 5,0 г.
Дрожжевой экстракт - 3,0 г.
Натрия хлорид - 15,0 г.
Глюкоза - 1,0 г.
Вода дистиллированная - 1,0 л.
Бромкрезоловый пурпурный (1,6%-й спиртовой раствор) - 0,6 мл.
Крезоловый красный (0,1%-й спиртовой раствор) - 5,0 мл.
L-аминокислота - 10,0 г
или DL-аминокислота - 20,0 г.
В воду очищенную вносят пептон ферментативный, дрожжевой экстрат, натрия хлорид и глюкозу. Подщелачивают 20%-м раствором гидроокиси натрия до рН 8,0 +/- 0,2. Варят текучим паром 40 мин. или кипятят до растворения ингредиентов. Фильтруют через ватный фильтр. Устанавливают рН 6,4 +/- 0,1 с помощью 18%-го раствора соляной кислоты. Добавляют навеску соответствующей аминокислоты (в контрольный вариант аминокислоту не добавляют). Затем вносят необходимые количества индикаторов. Среду разливают в стерильные, химически чистые пробирки по 1 - 2 мл и стерилизуют при 104 °С 20 мин. Цвет готовой среды - темно-сиреневый.
7.2.1.10. Среда Вагатцума для изучения гемолитической активности парагемолитических вибрионов.
Пептон ферментативный - 1,0 г.
Дрожжевой экстракт сухой - 0,3 г.
Натрия хлорид - 7,0 г.
Калий двузамещенный фосфорнокислый - 0,5 г.
Агар микробиологический (ГОСТ 17206-96) - 13,0 +/- 1,0.
Дистиллированная вода - 100,0 мл.
Все компоненты растворяют при нагревании, но не стерилизуют, добавляют 1 г маннита, 0,1 мл 0,1%-го спиртового раствора кристаллвиолета, 5 мл дефибринированной крови человека и разливают по чашкам.
7.3. Контроль питательных сред для выделения парагемолитических вибрионовКонтроль питательных сред и ингибиторов роста посторонней микрофлоры проводят в соответствии с "Инструкцией по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерного вибриона" 1983 г., утв. Начальником Главного управления карантинных инфекций МЗ СССР, используя вместо тест-штаммов холерного вибриона тест-штамм V. parahaemolyticus, а для оценки показателя ингибиции - Е. coli и P. vulgaris.
В качестве ингибиторов роста используют теллурит калия, контроль которого описан в упомянутой выше инструкции, и препарат "Прогресс", обеспечивающий торможение роения протея и алгинолитических вибрионов.
Каждая серия ингибиторов подлежит предварительному контролю на отсутствие бактерицидного эффекта по отношению к тест-штамму V. parahaemolyticus при обеспечении ингибирующего действия по отношению к тест-штаммам P. vulgaris и Е. coli.
Препарат "Прогресс" контролируют до и после его стерилизации при 0,5 атм. или кипячения на водяной бане в течение 20 мин.
Концентрацию препарата, необходимую для добавления в среды, определяют посевом 18 - 24-часовой культуры вульгарного протея в центр пластины агара с 0,05; 0,1; 0,2% "Прогресса". В качестве контроля используют среду без добавления ингибитора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток и определяют минимальную концентрацию препарата, подавляющую роение протея. На следующем этапе определяют чувствительность вибрионов тест-штамма V. parahaemolyticus к установленной ингибирующей дозе "Прогресса".
В три флакона со 100 мл 1%-й пептонной воды с "Прогрессом" добавляют по 0,1 мл взвеси, содержащей 100 клеток V. parahaemolyticus. Через 18 ч из каждого флакона высевают по 0,1 мл на пластины агара. Также поступают с контрольной средой без "Прогресса". Препарат считают пригодным, если через 18 ч выращивания в 1%-й пептонной воде с ингибитором и последующим высевом на плотную среду вырастает не менее 70% от количества в контроле.
7.4. Тест-штаммыС целью контроля ростовых свойств питательных сред используют тест-штаммы V. parahaemolyticus АТСС 17802, Е. coli 18 и P. vulgaris НХ19 N 222, а для контроля гемолитической и уреазной активностей - штаммы V. parahaemolyticus KM-187, КМ-186 соответственно и другие с аналогичными свойствами, разрешенные в установленном порядке к применению для этих целей в Российской Федерации.