"МЕТОДЫ САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.796-99" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22.12.99)
7.3. Методы испытания и отбора овицидов
Основными условиями методической работы должны быть: последовательность проведения опытов и их серий, выбор оптимальной концентрации химических веществ и экспозиции, оптимальная среда для испытуемого средства, правильное определение жизнеспособности яиц.
Лабораторные опыты проводят в двух сериях. В первой - определяют степень воздействия изучаемых химических веществ на яйца гельминтов на стадии дробления и стадии инвазионной личинки. Устанавливают концентрацию препаратов, экспозицию и стадию развития яиц.
Взвесь яиц гельминтов помещают в чашки Петри (по 600 - 800 в каждой) или бюксы. Начинают испытание препарата при 3%-ном разведении и экспозиции 30 мин. После этого яйца гельминтов отмывают водой вручную не менее 5, а с помощью центрифуги - не менее 2 раз. В контроле яйца гельминтов находятся в воде. Затем взвесь яиц гельминтов центрифугируют и выдерживают в термостате, меняя воду через каждые 2 - 3 суток. Жизнеспособность яиц (не менее 300) определяют через 15 - 20 суток общепринятыми методами. При выявлении эффективных овицидов исследования с ними повторяют, но уже в меньших концентрациях и, соответственно, экспозициях.
Во второй серии, испытывают выявленные эффективные препараты на яйца гельминтов в фекалиях. Испытывают только те препараты, которые проявили сильное или выраженное овицидное действие в первой серии. На дощечку (дерево, цемент) размером 10 х 15 см наносят 0,5 г фекалий, обсемененных яйцами гельминтов (5 яиц на 1 куб. см). Рабочие растворы или эмульсии испытуемых веществ наносят на дощечки с помощью пульверизатора из расчета 1 л/кв. м. Контрольные дощечки поливают водой. Исследования наиболее часто проводят при экспозиции от 30 до 180 мин. Затем фекалии собирают, промывают водой, выделяют яйца гельминтов и культивируют их в термостате. После определения их жизнеспособности устанавливают эффективность испытуемого средства.
Перед тем, как перейти к дальнейшей апробации выявленных овицидов, определяют их токсичность и коррозионную активность.
Испытуемые соединения оценивают по степени их овицидного действия по следующей схеме. В 1 серии опытов проводят отбор химических веществ, обладающих сильными, выраженными и слабыми овицидными свойствами, т.е. с высокой, средней и слабой эффективностью. К первым относятся соединения, которые в наиболее приемлемых концентрациях вызывают гибель всех яиц гельминтов; ко вторым - соединения, убивающие свыше 50% яиц; к третьим - соединения, вызывающие гибель менее 50% яиц гельминтов. Критерий экспозиции предусматривается в пределах 30 минут. Во 2 серии опытов экспозиция увеличивается до 60 минут.
В производственных условиях оценку препаратов проводят по результатам дезинвазии помещений. Дезинвазию оценивают высокоэффективной в том случае, если овицидный эффект (ОЭ) достигает 90 - 100%, удовлетворительной, если ОЭ равен 60 - 90%, неудовлетворительной, если ОЭ менее 60%. В данной оценке за основные критерии принимают допустимые концентрации препарата и экспозицию в пределах 3 часов.
Лабораторные опыты проводят в нескольких сериях. В первой серии используют деревянные ящики шириной 20 см, длиной 45 - 60 см, глубиной 20 - 30 см. Дно и стенки ящиков имеют отверстия, а внутри они разделены на секции, предназначенные для разных экспозиций испытуемых препаратов. В контроле используют отдельный ящик. Почву (разных видов) помещают в ящики послойно (15, 10, 5, 1 см), закладывают пробы яиц на стадии дробления и отдельно на стадии инвазионной личинки (в каждой пробе не менее 1000 яиц). Взвесь яиц гельминтов вносят на полоски фильтровальной бумаги и вокруг нее в почву, огражденную проволочным каркасом. Через 1 - 3 суток на опытные участки вносят рабочий раствор препарата, а на контрольные - воду. Первоначально испытывают 3%-ный раствор препарата при норме расхода 4 л/кв. м и экспозиции 1, 3, 5 суток. Затем эти пробы извлекают, отмывают от препарата (не менее 5 раз). Выделенные из проб яйца гельминтов культивируют в термостате (24 - 26 °С). Жизнеспособность их определяют через 15 - 20 суток общепринятыми методами. По результатам этих исследований оценивают овицидную эффективность препарата. Опыт повторяют, используя раствор другой концентрации и экспозиции.
Следующую серию опытов осуществляют с активными овицидами по такой же методике, но в почву при этом закладывают пробы фекалий, обсемененные яйцами гельминтов (извлеченные из концевых отделов маток гельминтов или полученные из фекалий зараженных животных). У наиболее перспективных овицидов определяют токсические и коррозионные свойства.
Полевые и полупроизводственные опыты проводят в условиях, исключающих доступ животных и людей. Составляют схему опытов. В первой серии исследования проводят на рыхлой почве, во второй - на твердой. В третьей - на рыхлой и твердой, но после внесения препарата поверхность объекта покрывают пленкой. Во всех сериях опытов участок делят на секции в зависимости от экспозиции. Последующую работу проводят так же, как в лабораторных условиях.
Производственные опыты осуществляют в микроочагах гельминтозов.
Составляют план-схему, в которой предусматривают место и количество обрабатываемой площади, концентрацию и норму расхода рабочего раствора препарата, экспозицию, количество проб почвы, которое необходимо взять до и после обработки объекта. Пробы берут с поверхности и глубины 5, 10 и 15 см (по 4 пробы в каждом случае). Каждую пробу берут на площади не менее 20 х 30 см (масса примерно 80 - 100 г). Эти пробы служат контролем.
Для получения более объективных данных об эффективности препарата на опытных и контрольных участках необходимо производить искусственную закладку проб с яйцами гельминтов. По данным жизнеспособности яиц определяют овицидную эффективность препарата и оценивают качество проведенной дезинвазии.
Определение овицидной эффективности различных средств
В основу метода положен принцип определения экстенсэффективности антигельминтиков и соотношение живых яиц в опыте и контроле. Приводим формулу расчета по Симонову А.П.:
ОЭ - овицидная эффективность препарата (%);
а1 - количество живых яиц гельминтов в опыте;
а2 - в контроле;
с1 - количество яиц, взятых для определения их жизнеспособности, в опыте;
с2 - в контроле;
Р1 - процент погибших яиц в опыте;
Р2 - процент живых яиц в опыте;
n - количество яиц, взятых для определения их жизнеспособности в опыте.
Этот метод может быть использован для определения ларвоцидной эффективности испытуемых средств.
Оценку степени эффективности овицидных средств в почве проводят так же, как и препаратов, испытываемых на твердых поверхностях. Различия обусловлены особенностями объекта обеззараживания и свойствами испытуемого средства. Препарат оценивается по его способности вызывать гибель зародышей гельминтов в различных слоях почвы. С этим же связано и увеличение экспозиции.