"МЕТОДЫ САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.796-99" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22.12.99)

7.5. Методы экспериментального изучения сроков развития и выживаемости яиц гельминтов в окружающей среде

При изучении сроков развития и выживаемости яиц гельминтов требуется проведение специальных экспериментов с искусственной закладкой проб на различных объектах окружающей среды. Опыты необходимо проводить, с одной стороны, в условиях наиболее приближающихся к естественным, а с другой, при которых пробы с яйцами гельминтов сохранялись бы в окружающей среде и их легко было бы извлекать для исследования в любые сроки.

Почва. На поверхности почвы закладку яиц гельминтов проводят одним из следующих способов:

а) на предварительный фильтр наносят не менее 1000 яиц гельминтов и покрывают его другим таким же фильтром, края которых загибают конвертами, после чего их укладывают на полосы плотного мельничного газа и прошивают. Расстояние между соседними фильтрами должно быть не менее 10 см, чтобы при извлечении конца ленты и забора для исследования 1 - 2 фильтров не нарушать другие; мельничный газ с пробами укладывают на поверхность опытного участка, а затем отбирают пробы для исследования;

б) на поверхности участка в почву на глубину 2 - 3 см вдавливают кювет из металлической сетки так, чтобы края его были на 2 - 3 мм выше ее поверхности. Кювет засыпают исследуемой почвой и обсеменяют яйцами гельминтов (из расчета не менее 1000 на 1 кв. см). И в том, и в другом случае пробы для исследования отбирают: весной и осенью 1 раз в 10 суток, летом через каждые 3 - 5 суток, зимой 1 раз в месяц.

При изучении сроков выживаемости яиц гельминтов в почве на разных глубинах (5, 10, 20, 40, 60 см) закладку их целесообразно проводить в специальных пробах.

В опытах применяют яйца тех видов гельминтов, которые представляют наибольшую эпидемиологическую опасность в данной местности. Если нужно установить максимальные сроки выживаемости яиц гельминтов, целесообразно ставить опыты с яйцами аскарид. При этом могут быть использованы как яйца A. lumbricoides, так и A. suum, полученные из рогов матки аскариды, прилегающих к вагине не далее 1 - 1,5 см, а также из фекалий с высокой интенсивностью инвазии (не менее 2 - 3 яиц гельминтов в поле зрения).

Получение чистой взвеси яиц аскарид: порцию фекалий (объемом в столовую ложку) помещают в центрифужную пробирку объемом 150 - 250 мл (лучше в пробирку объемом 250 мл) и заливают водопроводной водой (30 - 120 мл), после чего смесь тщательно размешивают палочкой до образования гомогенной массы и центрифугируют в течение 2 - 3 минут при скорости 800 об./мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют такую же порцию чистой воды; смесь снова размешивают и центрифугируют.

Промывание повторяют не менее 2 - 3 раз. Затем к осадку добавляют насыщенный раствор натрия хлорида (плотность 1,2), смесь размешивают, всплывшие крупные частицы снимают, а смесь центрифугируют 2 - 3 минуты и петлей с поверхности раствора снимают пленку. Эти операции повторяют до тех пор, пока в контрольной капле, взятой на предметное стекло, будут попадаться лишь единичные яйца гельминтов. Затем начинают второй этап - выделение яиц гельминтов из слабого раствора соли.

Содержимое сосудов отстаивают в течение 2 - 3 часов, после чего надосадочную жидкость сливают, а осадок фильтруют через 4 - 5 слоев марли или мелкоячеистую сетку на часовые стекла диаметром 10 - 15 см. Легкими круговыми движениями производят закручивание осадка к центру часового стекла, а оставшуюся по периферии жидкость отсасывают пастеровской пипеткой с резиновой грушей. На часовые стекла добавляют небольшое количество воды, смесь снова размешивают и закручивают к центру стекла: такую операцию повторяют до тех пор, пока на стекле не будет чистая взвесь яиц гельминтов. Наблюдение за чистотой взвеси яиц гельминтов проводят под микроскопом. Полученную чистую взвесь переносят в стеклянные бюксы с крышкой, этикетируют и помещают на хранение в холодильник.

Приготовление тест-объектов. Для приготовления тест-объектов используют алюминиевые или пластмассовые бигуди, применяемые для завивки волос. Такой каркас удобен тем, что со всех сторон доступен для почвенного воздуха, влаги, почвы; кроме того, он может долго пролежать в земле, а при выкапывании предохраняет пробу почвы от разрушения. Каркас взвешивают, заполняют исследуемой почвой и снова взвешивают, по разности полученных показателей определяют массу почвы.

Через отверстия в бигуди в почве делают несколько углублений (в разных местах), в которые вносят с помощью пипеток необходимое количество капель раствора с взвесью яиц гельминтов так, чтобы на 1 г почвы их приходилось не менее 1000. Среднее количество яиц гельминтов в одной капле определяют следующим образом: на предметное стекло наносят 5 - 10 капель хорошо перемешанной взвеси. Под микроскопом подсчитывают их количество в каждой капле, суммируют и делят на число капель.

Необходимое для внесения в тест-объект количество капель взвеси определяют по формуле:

где:

n - число капель суспензии из яиц гельминтов;

Р0 - масса упаковки-контейнера без почвы;

Р1 - масса упаковки с почвой;

к - среднее число яиц гельминтов в 1 капле;

1000 - содержание яиц гельминтов в 1 г почвы после обсеменения.

После внесения взвеси яиц гельминтов углубления в каркасе заполняют почвой. Тест-объект заворачивают в мельничный газ, после чего к нему прикрепляют проволоку длиной на 5 - 10 см больше глубины закладки их в почву. После помещения тест-объектов в почву на концах проволоки, выведенных наружу, устанавливают опознавательные знаки. Лучше всего пробы (тест-объекты) готовить в лаборатории и хранить до постановки опыта в холодильнике.

Для закладки тест-объектов на выбранных участках выкапывают ямы шириной 1 - 1,2 м. Длину их рассчитывают в каждом конкретном случае отдельно (в зависимости от количества испытуемых проб). На дно ям укладывают пробы (тест-объекты) на расстоянии 20 - 30 см друг от друга; ямы засыпают сначала той почвой, которая выбрасывалась последней при копке ям; на поверхности полученных грядок устанавливают опознавательные знаки.

Количество тест-объектов должно быть рассчитано на длительный период наблюдения (7 - 10 лет), выемку их для исследования производят в зависимости от климата, характера почв и глубины закладки - не реже 1 раза в месяц при исследовании тест-объектов с глубины до 20 см и не реже 1 раза в квартал при более глубоких закладках. Учитывая, что тест-объекты для исследования можно забирать (для средней полосы России) только с апреля по октябрь, т.е. в течение 7 месяцев, легко подсчитать число тест-объектов, необходимых для закладки на ту или иную глубину (на глубину 5, 10, 20 см в среднем 49 - 70 штук; на глубину 40 и 60 см - 21 - 30 штук).

По опознавательным знакам определяют места нахождения тест-объектов, выкапывают ямы размером 30 х 30 см так, чтобы между стенкой ямы и ближайшим тест-объектом был оставлен слой почвы не менее 10 см. Изъятые из почвы тест-объекты помещают в пакеты из бумаги или целлофана и доставляют в лабораторию для исследования. При определении стадии развития или признаков деформации в каждом опыте необходимо просматривать не менее 100 - 200 яиц гельминтов.

Для изучения сроков развития и выживаемости личинок анкилостомид и стронгилоидов в почве рекомендуется следующая методика: фекалии, содержащие яйца анкилостомид, смешивают с почвой в пластмассовых кюветах (на дне которых просверлены отверстия); последние помещают в почву экспериментальных участков на 7 - 10 дней и ведут ежедневно отбор проб обсемененной почвы для исследования по методу Бермана. Поиск проводят до тех пор, пока вылупившиеся из яиц личинки не достигнут инвазионной стадии, а затем погибнут.

Вода. Для изучения сроков выживаемости яиц гельминтов в воде несколько капель насыщенной взвеси их (не менее 1000) наносят пипеткой на предварительные планктонные фильтры, сложенные воронками. Для устойчивости воронки помещают в штатив из небольшой картонной крышки, в которой сделаны ячейки. После внесения яиц края воронок загибают и вместе с этикетками, указывающими даты и номера опытов, помещают по 2 - 3 экземпляра в стеклянные трубки. Наиболее удобными являются трубки длиной около 7 см, диаметром 2 см с небольшими раструбами, за которые с обеих сторон закрепляют сатин при завязывании отверстий трубок.

В металлическую сетку заворачивают по 3 - 4 трубки и на капроновом шнуре опускают в воду. Если пробы намечено поставить в местах с быстрым течением воды, для удержания проб на необходимой глубине к сетке подвешивают дополнительный груз. Серия из 3 - 4 трубок, связанных вместе, составляет 1 опыт. Часть трубок подвешивают у дна, остальные на различном расстоянии от него. Для просмотра берут по 1 трубке из каждого опыта. Подсчитывают не менее 200 яиц, смытых с фильтра на предметное стекло.

Овощи. Яйца гельминтов (не менее 1000) наносят непосредственно на овощи. Сроки их нахождения на овощах определяют временем роста последних. Опытные овощи помечают, а через нужное время забирают на исследование. Яйца гельминтов очищают скальпелем с поверхности овощей на фильтр и помещают во влажную камеру для развития их в оптимальных лабораторных условиях.

Наблюдения показали, что яйца гельминтов на овощах, не защищенных листьями, смываются дождем. Поэтому взвесь яиц гельминтов целесообразно помещать на фильтрах, которые с помощью ниток крепко фиксируют на поверхности овощей. Для исследования берут не менее 3 фильтров, в каждом из них просматривают не менее 200 - 300 яиц гельминтов, определяя их стадию развития или признаки деформации.