"МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ ЛЕЧЕБНЫХ ГРЯЗЕЙ" (утв. Минздравом СССР 11.09.89 N 143-9/316-17)

Выполнение анализа

К 100 мл основного разведения грязевой суспензии добавляют 10 мл концентрированной ЛПС, к 10 мл основного разведения - 1 мл концентрированной ЛПС, в пробирки с 9 мл неконцентрированной ЛПС добавляют 1 мл основного разведения и последующих.

Инкубацию проводят при температуре 37 град. С в течение 24-48 часов. Через 24 часа посевы просматривают и отмечают в них наличие или отсутствие газообразования и помутнения среды. При отсутствии через 48 часов помутнения в колбах и пробирках дают отрицательный ответ.

3.1.1. Определение лактозоположительных кишечных палочек

В качестве основного показателя степени фекального загрязнения пелоидов определяют лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП) или колиформные бактерии, которые входят в семейство Enterobacteriaceae. К ним относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при 37 град. С в течение 21 часа, с отрицательным оксидазным тестом.

При наличии в колбах и пробирках газообразования и помутнения через 24 часа инкубации производят высев на среду Эндо, разделенную на 3-4 сектора с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Чашки инкубируют 16-18 часов при температуре 37 град. С.

При наличии типичных колоний красных с металлическим блеском, розовых с красным центром, розовых выпуклых слизистых и др. проверяют оксидазную активность. Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий Pseudomonadaceae и других видов сапрофитных бактерий; на среде Эндо P. aeruginosa растут в виде плоских колоний сиреневого цвета с неровными краями, оксидазоположительные.

Постановка оксидазного теста при этом осуществляется следующим образом: петлей или стеклянной палочкой снимают изолированные колонии со среды Эндо и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную специальным реактивом (Приложение 3, п. 5).

Через 1-3 минуты культура окрашивается в ярко-синий цвет при положительной реакции на оксидазу и не изменяется при отрицательной. Если оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко, то для подтверждения результата изолированные колонии можно пересеять на скошенный питательный агар и после подращивания повторить оксидазный тест. Оксидазный тест можно определять системой индикаторных бумажек (СИБ).

При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний с отрицательной оксидазной активностью их микроскопируют.

При наличии грамотрицательных палочек засевают по 2-3 колонии каждого типа в полужидкую или жидкую с поплавком среду с лактозой для подтверждения ферментации лактозы. Учет производят через 4-5 и 18 часов инкубации при 37 град. С. Если за это время происходит образование кислоты и газа, то это свидетельствует о наличии лактозоположительных кишечных палочек в исследуемом разведении грязи. Признаком газообразования является появление пузырьков газа; об образовании кислоты свидетельствует изменение цвета среды. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного ответа через 24 часа. При отсутствии газообразования через этот срок получают окончательный отрицательный ответ, при наличии газообразования - положительный результат.

В тех лабораториях, где учет на полужидкой среде с лактозой не может производиться через 4-5 часов, следует применять лактозопептонную среду с поплавками. В этом случае учет результатов производят через 10-24 часа.

Обнаружение в грязи колиформных бактерий следует рассматривать как показатель фекального загрязнения грязи, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения. Количество колиформных бактерий выражают через коли-титр.

После выделения колиформных бактерий устанавливается титр, при этом принимается то предельное разведение грязи, которое дало положительный ответ.

Например: если положительный результат отмечается в пробирке с 1 мл основного разведения, а в последующем разведении бактерии ЛКП не обнаружены, то коли-титр будет равен 0,1.

3.1.2. Определение фекальных колиформных бактерий

К группе фекальных колиформных бактерий относятся E. Coli, Klebsiella и др. - грамотрицательные, не образующие спор палочки, способные ферментировать лактозу до кислоты и газа при 44 +/- 0,5 град. С. Обнаружение фекальных колиформных бактерий указывает на наличие свежего фекального загрязнения.

Для подтверждения принадлежности лактозоположительных колоний к фекальным колиформным бактериям со среды Эндо несколько колоний каждого типа с отрицательным оксидазным тестом пересевают в пробирки с лактозным бульоном, содержащим борную кислоту.

Засеянные пробирки инкубируют при температуре 44 +/- 0,5 град. С в течение 24 часов. Положительный ответ дают при наличии помутнения и газообразования.

Срок анализа можно сократить, если из сред накопления, где обнаружен газ, одновременно с высевом на среду Эндо для подтверждения наличия лактозоположительных кишечных палочек производят высев пипеткой в количестве 2-3 капли в лактозный бульон с борной кислотой. Посевы инкубируют при температуре 44 +/- 0,5 град. С, определяя при этом преимущественно фекальные колиформные бактерии.

3.1.3. Определение энтерококков

Энтерококки - грамположительные, полиморфные круглые, чаще слегка вытянутые с заостренными концами диплококки, располагающиеся попарно или в коротких цепочках. Определяют для подтверждения фекального загрязнения.

Из накопительной среды (ЛПС), где имеет место помутнение, делают высев на сектора элективной молочно-ингибиторной среды (МИС). Через 24-48 часов инкубации посевов на МИС при температуре 37 град. С в качестве положительных результатов отмечают наличие аспидно-черных выпуклых с металлическим блеском, а также сероватых мелких колоний.

Молочно-ингибиторная среда позволяет дифференцировать виды энтерококков: S. faecalis образуют аспидно-черные выпуклые колонии с металлическим блеском; S. faecalis биовар liguefaciens такие же колонии, окруженные зоной просветления с выпадением по периферии осадка параказеина повышенной мутности; S. faecium и биовар durans мелкие серые плоские колонии.

Типичные колонии микроскопируют и отсевают на косяк с МПА. Вместо среды МИС можно использовать также среду Турчинского. Обнаружение грамположительных, слегка вытянутых с заостренными концами диплококков, часто располагающихся короткими цепочками, свидетельствует о наличии энтерококков. С культурой, выросшей на косяке, ставится каталазная проба. Для этого на газон роста наносится 3-процентная перекись водорода. При наличии пузырьков газа культура считается каталазоположительной (сарцины, стафилококки и др.).

Энтерококки - каталазоотрицательные микроорганизмы.

3.1.4. Определение P. aeruginosa

P. aeruginosa - грамотрицательные, мелкие подвижные, оксидазоположительные палочки. Спор не образуют, не ферментируют, но окисляют глюкозу до кислоты, имеют пигмент сине-зеленой окраски.

Посев исследуемого материала осуществляют из накопительной среды ЛПС (3.1) на среду "Блеск", и чашки инкубируют при 42 град. С 24 часа. Высев следует производить с расчетом получения максимального количества изолированных колоний. Колонии P. aeruginosa на среде "Блеск" темно-красного цвета, плоские, нередко принимают веретенообразную форму, сплошь покрыты золотистым налетом либо содержат многочисленные вкрапления, иногда окруженные светло-красным ободком или бесцветным венчиком.

Культура P. aeruginosa обладает специфическим ароматическим запахом земляничного мыла, жасмина, фиалки, цветов липы и др. Для идентификации P. aeruginosa со среды "Блеск" снимают 1-3 наиболее типичных колонии с золотистым блеском, микроскопируют. Грамотрицательные культуры засевают уколом в столбик среды Хью-Лейфсона (OF) для определения оксидации и ферментации глюкозы и одновременно макроколониями (бляшками) на среду Кинг-А, а также на косяк с МПА. На среде Кинг-А на одной чашке можно разместить от 16-18 до 24 макроколоний.

Посевы инкубируют при температуре 37 град. С в течение 24-48 часов, а затем учитывают результаты. Р. aeruginosa окисляют глюкозу, но не ферментируют ее, первоначальный зеленый цвет среды OF изменяется в верхней части столбика на желтый (+), нижняя остается зеленой (-). Результат учитывается как OF (+/-). Enterobacteriaceae изменяют среду OF в желтый цвет (+/+) и не учитываются.

На среде Кинг-А колонии плоские, с шероховатой поверхностью, неровными краями и кружевным венчиком; при косом освещении улавливается серебристый блеск. Характерно наличие окрашиваемого пигмента. При отсутствии пигмента посевы оставляют еще на сутки при комнатной температуре. Пигмент образуется вокруг колоний и диффундирует в толщу среды. Культуру, выросшую на косяке, проверяют на оксидазную активность. При этом колонии P. aeruginosa в течение 15-20 секунд становятся темно-синими.

При наличии оксидазоположительных бактерий, продуцирующих пигмент и дающих на среде "Блеск" золотистый налет, идентификацию P. aeruginosa можно считать законченной.

Количественный учет P. aeruginosa выражается в титре аналогично коли-титру.

3.2. Определение сульфитвосстанавливающих клостридий в лечебных грязях Сульфитвосстанавливающие клостридии, преимущественно C. perfingens, - крупные неподвижные палочки, не образующие цепочки, грамположительные, анаэробные, толстые с "обрубленными" или слегка закругленными концами, жгутиков не имеют, образуют споры. Характерным признаком является высокая ферментативная активность, расщепление сахаров с образованием кислоты и газа, быстрое и бурное свертывание молока с образованием сгустка и отделением сыворотки, а также способность редуцировать сульфит натрия (Na2SO3) при 45 +/- 1 град. С в течение 16-18 часов на железо-сульфитной среде.

1 мл основного и последующих разведений лечебной грязи (0,1; 0,01) переносятся в два ряда параллельных пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80 град. С в течение 15 минут или 90 град. С в течение 10 минут для уничтожения вегетативной микрофлоры. Затем во все пробирки наливают по 9-10 мл среды Вильсон-Блера, приготовленной extempore.

Пробирки заливают расплавленной средой (50-60 град. С) и быстро опускают в холодную воду для немедленного охлаждения и удаления воздуха из среды. Инкубируют посевы при температуре 44-45 град. С в течение 24 часов. При наличии клостридий в пробирках через 4-5 часов образуются колонии черного цвета. Микроорганизмы фекального происхождения при 45 град. С такую реакцию не дают.

После учета черных колоний производят их пересев на молочную среду для дальнейшей идентификации. Для этого петлей переносят колонии в пробирки с молочной средой, которые инкубируют при 44-45 град. С 24 часа.

При развитии клостридий наблюдается образование губчатого сгустка молока, приподнятого кверху, жидкость при этом становится прозрачной, слегка желтоватой.

Для подтверждения наличия клостридий проводят микроскопирование. Обнаружение грамположительных палочек указывает на присутствие клостридий.

Титр устанавливают по максимальному разведению, в котором обнаружены клостридии.

3.3. Определение общего микробного числа (ОМЧ)

Для характеристики общего микробного загрязнения пелоидов определяют численность сапрофитных микроорганизмов, способных расти на мясопептонном агаре при 30 град. С 48-72 часов.

1 мл приготовленных грязевых разведений вносят в стерильные чашки Петри и заливают расплавленным и остуженным до 45 град. С мясо-пептонным агаром в количестве 15-20 мл. Учитывая практический опыт, целесообразно проводить высев из разведений 0,01; 0,001; 0,0001. Посев каждого разведения производят не менее чем на 2 чашки. Содержимое чашки Петри быстро смешивают, равномерно распределяя его по всей поверхности, после застывания агара чашки помещают в термостат и инкубируют при температуре 30 град. С в течение 48-72 часов.

Для подсчета выросших колоний берут такие разведения, при которых на чашках вырастает от 30 до 300 колоний. Если вырастает более 300 колоний, то ведется счет на 1/4 площади чашки с последующим перерасчетом на всю площадь. Из суммы колоний, подсчитанных на всех чашках, выводят среднее арифметическое и затем определяют число колоний на 1 г почвы (с учетом разведений).

Результат можно представить на основании подсчета колоний на одной чашке, если на других чашках:

- рост расплывчатых колоний распространился на всю поверхность чашки;

- число колоний превышает 300;

- при посеве из разбавлений выросло менее 30 колоний.

Если рост расплывчатых колоний распространяется на всю поверхность чашки и подсчет невозможен, то посев проб производят повторно. Чтобы помешать развитию на поверхности агара спорообразующих микробов и бактерий рода Proteus в Н-форме, чашки Петри заливают голодным агаром, расплавленным и остуженным до 45-50 град. С слоем толщиной 3-4 мм.

3.4. Определение стафилококков

Стафилококки объединяются в род Staphylococcus. Это грамположительные кокки, имеющие правильную шаровидную форму, обладающие активной каталазой, ферментирующие глюкозу в анаэробных условиях с выделением кислоты, как правило, образующие пигмент на питательных средах.

S. aureus - потенциально патогенный микроорганизм, отличительным признаком является способность коагулировать плазму крови, ферментировать маннит в анаэробных условиях, обладающий лецитовителлазной активностью. S. epidermidis вегетирует на кожных покровах человека, не являясь болезнетворным, но в отдельных случаях может вызвать септические процессы у ослабленных больных.

Выполнение анализа: к 100 мл основного разведения грязевой болтушки добавляют 10 мл 25-процентного пептона и 10 г хлорида натрия. К 10 мл основного разведения грязевой болтушки добавляют 1 мл 25-процентного пептона и 1 г хлорида натрия. Посевы инкубируют при 37 град. С в течение 24-48 часов. Высев из флаконов и пробирок проводят на молочно-желточно-солевой агар (МЖСА) и инкубируют при 37 град. С в течение 24-48 часов.

Учитывают блестящие выпуклые колонии белого, палевого, золотистого цвета, окруженные радужной с перламутровым блеском зоной, что свидетельствует о наличии лецитовителлазной активности; отмечают пигментообразование, микроскопируют. Далее с МЖСА на скошенный агар снимают в первую очередь колонии стафилококков, образующие радужный венчик, пигментированные колонии с отрицательной лецитовителлазной реакцией. При отсутствии на чашках пигментированных колоний и колоний с положительной лецитовителлазной реакцией для исследования снимают беспигментные колонии, похожие по морфологии на стафилококки. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отсевать не менее двух колоний различного вида.

Для подтверждения принадлежности таких бактерий к S. aureus определяют плазмокоагулазную активность в соответствии с "Методическими рекомендациями по видовой идентификации стафилококков" N 1922-78.

При наличии мелких грамположительных кокков, располагающихся в виде гроздей, способных коагулировать плазму и чаще всего обладающих лецитовителлазной активностью, дают положительный ответ.