"МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ ЛЕЧЕБНЫХ ГРЯЗЕЙ" (утв. Минздравом СССР 11.09.89 N 143-9/316-17)

Приложения

Приложение N 1

Приложение N 1. СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛКП, ФЕКАЛЬНЫХ КОЛИФОРМ, P. AERUGINOSA, ЭНТЕРОКОККОВ В ЛЕЧЕБНЫХ ГРЯЗЯХ

Приложение N 2

Приложение N 2. АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
Оборудование

Автоклав электрический по ГОСТ 9586-61

Термостат электрический с автоматическим регулированием

Холодильник бытовой электрический с температурой в камере +4-6 град. С

Холодильник походный (сумка) для транспортировки проб

Микроскоп биологический по ГОСТ 8284-78 или другого типа, обеспечивающий увеличение в 600 раз, с осветителем

Осветитель ОИ-19

Лупа по ГОСТ 8309-57

Аквадистиллятор Д-4-2 или другого типа

Прибор для счета колоний

рН метр (ионометр)

Шкаф сушильный стерилизационный, обеспечивающий температуру 180 град. С в течение 1-2 часов

Аппарат для встряхивания жидкостей в пробирках и колбах (шуттель-аппарат)

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-80 4-го класса точности

Разновесы

Лотки эмалированные.

Лабораторная посуда

Колбы различной емкости (50, 100, 250, 500 и 1000 мл)

Чашки бактериологические Петри по ГОСТ 7900-56

Шпатели стеклянные и металлические

Пипетки емкостью 1, 2, 5 и 10 мл

Стеклянные банки разные

Стеклянные бусы

Воронки стеклянные

Цилиндры вместимостью 100, 200 и 500 мл

Стаканы лабораторные по ГОСТ 10394-63

Стекла покровные для микропрепаратов

Стекла предметные для микропрепаратов

Пробки разные (резиновые, ватные).

РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СРЕД И ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Приложение N 3

Приложение N 3. РЕЦЕПТУРА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1. Среда для определения бактерий группы кишечной палочки

Приготовление лактозопептонной среды:

а) нормальной концентрации: 10 г пептона, 5 г натрия хлористого (NaCl), 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды рН 7,4-7,6. Разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве при 112 град. С (0,5 кгс/кв. см) 30 минут;

б) концентрированная: готовят так же, как и среду нормальной концентрации, но с добавлением на 1000 мл дистиллированной воды 50 г NaCl, 50 г лактозы, 100 г пептона.

2. Приготовление полужидкой среды с лактозой

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г NaCl, 4-5 г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2-7,4; добавляют 1 мл 1,6-процентного спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при 120 град. +/- 2 град. С в течение 20 минут. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы, нагревают до кипения. Разливают в стерильные пробирки столбиком высотой 3 см и стерилизуют при 112 град. С (0,5 кгс/кв. см) 12 минут. Срок хранения не более 2-х недель.

Приготовление полужидкой среды с лактозой из сухого препарата с ВР - по прописи на этикетке. Срок хранения - не более 7 суток.

3. Приготовление среды Эндо (модификация)

Готовят из сухого препарата по прописи на этикетке. Чашки перед посевом подсушивают в термостате. Срок хранения - не более двух суток в темноте. В готовую и охлажденную до 60-70 град. С среду перед разливкой в чашки до 20-25 мл допускается добавлять на 100 мл среды: 0,2 мл 100-процентного спиртового раствора основного фуксина для повышения дифференцирующих свойств среды и 0,2 мл 5-процентного - спиртового раствора розоловой кислоты во избежание зарастания посевов споровыми аэробами. Чашки со средой перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения раствора фуксина и розоловой кислоты - не более одного месяца.

4. Приготовление борнокислой буферной среды с лактозой

10 г пептона, 12,2 г калия фосфорнокислого двузамещенного (безводного), 4,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного (безводного), 4,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного (безводного), 3,2 г борной кислоты (требуется точное взвешивание), 5 г лактозы растворяют в 1 л дистиллированной воды, разливают по 5 мл в пробирки с поплавками, стерилизуют при температуре 112 град. С 0,5 кгс/кв. см 12 минут. Срок хранения - не более двух недель. Каждую новую партию среды целесообразно проверять на штамме E. Coli.

5. Приготовление реактива для определения оксидазной активности бактерий

30-40 мг альфа-нафтола растворяют в 2,5 мл ректификованного этилового спирта, добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и растворяют 40-60 мг диметил-фенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением.

6. Приготовление питательного агара

Готовят из сухого препарата по прописи на этикетке, стерилизуют при 120 град. С (1 кгс/кв. см) 30 минут.

7. Приготовление среды Вильсон-Блер

К 100 мл расплавленного и затем охлажденного до температуры 80 град. С щелочного питательного агара с 1% глюкозы добавляют 10 мл 20-процентного раствора сернистокислого натрия и 1 мл 8-процентного раствора хлорного железа. Можно использовать и обычный питательный агар, но перед применением дополнительно добавляют 10 мл 25-процентной глюкозы и 0,5 мл 10-процентной щелочи. Водные растворы солей готовят на стерильной дистиллированной воде и стерилизуют в течение часа текучим паром. Сернистокислый натрий можно заменить серноватистокислым натрием, а хлорное железо - сернокислым.

8. Приготовление среды для определения оксидации и ферментации (OF) (среда Хью-Лейфсона)

К 100 мл дистиллированной воды добавить 0,2 г пептона, 0,5 г хлорида натрия, 0,03 г K2HPO4, 0,3 г агар-агара, 1 г углевода (глюкоза, фруктоза), 0,3 мл 1-процентного водного раствора бромтимолового синего. Среду кипятить до полного растворения ингредиентов, установить рН 7,0-7,2, разлить по 3-4 мл в пробирки, стерилизовать при температуре 112 град. С (0,5 кгс/кв. см) 15 минут. Остудить столбиком.

9. Среда "Блеск" и "Кинг-А" для идентификации P. aeruginosa

9.1. Среда "Блеск". Мясо-пептонного стерильного 2-процентного агара 100 мл, молока стерильного снятого 10 мл, 10-процентного водного раствора трифенилтетразола хлорида 8 мл, аргинина гидрохлорида 0,3 г. В расплавленный мясо-пептонный агар прибавить аргинин, раствор трифенилтетразол хлорида (самостерилизуется после хранения при комнатной температуре 2-3 дня) и стерильное снятое молоко размешать и разлить в 6-7 чашек.

9.2. Среда Кинг-А. Пептона 2 г, агар-агара 1,5 г, глицерина 1,0 г, сульфата калия 1,0 г, хлорида магния 0,14 г, воды дистиллированной до 100 мл, рН 7,2. Стерилизовать при температуре 112 град. С (0,5 кгс/кв. см) 15 минут, разлить на 6 чашек.

10. Приготовление среды Турчинского

К 600 мл дистиллированной воды добавляют 400 мл желчи, 35-40 г сухого питательного агара, по 5 г фосфата калия однозамещенного и двузамещенного, 5 г натрий-аммоний фосфата. Расплавляют при нагревании, разливают во флакон и стерилизуют при 120 град. С (1 кгс/кв. см) 20 минут. Перед употреблением в расплавленный и охлажденный агар добавляют на каждые 100 мл среды 0,5 г глюкозы; 1 мл 1-процентного водного раствора ТТХ, 0,6 мл 1-процентного водного раствора метиленового синего (хранить не более 14 дней), 20000 ЕД полимиксина М, 1-2 мл 0,1-процентного спиртового раствора фурациллина. Тщательно размешать, разлить в чашки Петри толстым слоем 20-25 мл.

11. Приготовление молочно-ингибиторной среды (МИС)

Готового питательного агара 85 мл, стерильного снятого молока 15 мл, 0,01-процентного раствора водного кристаллического фиолетового 1,25 мл, теллурита калия 2-процентного водного раствора 1 мл. Все хорошо смешать и разлить в чашки Петри.

12. Тест Грегерсена

Простой, быстрый способ, заменяющий окраску по Граму и не требующий оптики.

В капле 3-процентного раствора KOH на предметном стекле эмульгируют бактериальную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивают петлей, взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемых микроорганизмов к грамотрицательным. У грамположительных микроорганизмов реакция отрицательная.

13. Молоко по Тукаеву

К 1-процентной пептонной воде прибавляют 5-6% обезжиренного молока, среду стерилизуют при 112 град. С (0,5 кгс/кв. см) 12 минут.

14. Каталазный тест

Каплю 3-процентного раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки водорода.

15. Приготовление молочно-желточно-солевого агара (МЖСА)

Сухой питательный агар по прописи на этикетке и 90 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, разливают мерно в сосуды, стерилизуют при 120 град. С 20 минут.

Перед употреблением в расплавленный и остуженный до 50-55 град. С солевой агар добавляют:

- стерильное обезжиренное молоко - 60 мл;

- один яичный желток, тщательно смешанный с 50 мл физиологического раствора с помощью стеклянных бус;

- полимиксин М (раствор хранят не более 14 суток) 300000 ЕД (при наличии постороннего роста).

Тщательно смешивают и разливают в чашки Петри.