"МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ В РЫБЕ, НЕРЫБНЫХ ОБЪЕКТАХ ПРОМЫСЛА, ПРОДУКТАХ, ВЫРАБАТЫВАЕМЫХ ИЗ НИХ, ВОДЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ И ДРУГИХ ОБЪЕКТАХ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2046-06" (утв. Роспотребнадзором 30.01.2006)
5. Схема бактериологического анализа
Метод основан на выявлении в посевах исследуемого материала на элективных агаровых средах колоний, подозрительных на парагемолитические вибрионы, последующего выделения из них чистой культуры и идентификации ее по набору признаков, определяющих принадлежность к виду V. parahaemolyticus.
В работе используют готовые питательные среды, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке, и лабораторного изготовления. Обогатительные и элективные среды должны содержать натрия хлорида до 3%, а дифференциально-диагностические - от 1,5 до 3,0%.
5.1. Исследование пищевых продуктовПорядок исследования и содержание работы по этапам схематически представлены на рис. 1.
Рис. 1
СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ НА ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ ВИБРИОНЫ
Обозначения: п.в. - пептонная вода; ПУС - полиуглеводная среда; ЩА - щелочной агар; ЭС - элективная среда.
При количественном анализе из разведений пробы 1:10, 1:100 и 1:1000 высевают по 0,1 мл на 2 чашки с элективной агаровой средой, например: питательной средой элективно-дифференциальной для выделения холерного вибриона сухой - СЭДХ - ВФС 42-411 ВС-93, селективной средой для выделения патогенных вибрионов - TCBS или дифференциально-диагностический агар с пенициллином - ДДА (п. 7.2.1.6.). Посевной материал распределяют по поверхности агара и дают подсохнуть. Посевы помещают в термостат при (37 +/- 0,5) °С на 18 - 24 ч.
При качественном анализе посевы в накопительные среды инкубируют при (37 +/- 0,5) °С в течение 18 - 20 ч, после чего делают высев петлей с поверхностного слоя обогатительной среды на 1 - 2 чашки элективной среды для получения роста в виде изолированных колоний.
5.1.1. Отбор колоний и идентификация выделенных культур
Изучают рост на элективных средах, отбирают подозрительные на парагемолитические вибрионы колонии. При количественном анализе для подсчета отбирают чашки с посевом двух последовательных разведений, где выросло не более 300 колоний. Необходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 15 колоний. С каждой из 4-х отобранных для подсчета чашек отсевают по 5 колоний. Парагемолитические вибрионы на элективной среде формируют колонии правильной округлой формы, плосковыпуклые, полупрозрачные в проходящем свете, с влажной блестящей поверхностью, размером 2 - 3 мм в диаметре, не отличающиеся по цвету от голубовато-зеленого цвета элективных сред (СЭДХ, TCBS, ДДА), т.к. вибрионы этого вида не ферментируют сахарозу, входящую в них. Подозрительные колонии отсевают на щелочной агар - питательную среду для выделения и культивирования холерного вибриона, сухую (ФС 42-213 ВС-88) и на одну из полиуглеводных сред Ресселя (п. 7.2.1.7), Клиглера (ФС 42-3387-97) или другие с аналогичными характеристиками, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке.
На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичным для парагемолитических вибрионов ростом. На среде Ресселя и Клиглера отмечают характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части агара.
Культуры, выросшие на щелочном агаре, изучают на наличие цитохромоксидазы. Из оксидазопозитивных готовят мазки по Граму.
Для дальнейшей идентификации отбирают оксидазопозитивные грамотрицательные культуры с характерным ростом на полиуглеводных средах. Отобранные культуры изучают по набору признаков (подвижность, лизиндекарбоксилаза, аргининдигидролаза, индол, рост в средах с различными концентрациями натрия хлорида, ферментация/окисление глюкозы на среде Хью и Лейфсона (п. 7.2.1.8), арабинозы, сахарозы, целлобиозы, салицина, реакция Фогес-Проскауэра), методами, описанными в разделе 6 и методических указаниях МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры".
При расследовании случаев заболевания, обусловленных V. раrаhaemolyticus, выделенные культуры изучают по расширенному набору признаков, приведенному в табл. 1, а также по тестам внутривидовой дифференциации: серотипированию и феномену Канагава.
Таблица 1
СВОЙСТВА ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ И СХОДНЫХ С НИМИ МИКРООРГАНИЗМОВ
+ положительный результат в 90%;
- отрицательный результат в 90%;
+/- признак вариабелен;
+(-) или -(+) в скобках - редко наблюдаемый результат;
* - V. anguillarum реклассифицирован в Listonella anguillarum (Mcc Donell M.T., Colwell R.R., 1985), является возбудителем инфекционного заболевания рыб и других гидробионтов, обитающих в соленых и реже - в пресных водоемах. Роль в патологии человека микроорганизмов этого вида не установлена;
О/Ф тест окисления/ферментации глюкозы в среде Хью-Лейфсона.
Количество парагемолитических вибрионов в 1 г продукта (N) в соответствии с ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований" подсчитывают по формуле:
SUM а - сумма парагемолитических вибрионов, рассчитанная по формуле:
а - количество вибрионов для каждой чашки;
b - количество колоний, микроорганизмы которых идентифицированы как V. parahaemolyticus;
А - количество колоний, отобранных для идентификации;
С - общее число выросших на чашке колоний;
V - объем посевного материала, внесенного в каждую чашку, куб. см;
n1 - количество отобранных для подсчета чашек в первом разведении;
n2 - количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении;
d - коэффициент разбавления, соответствующий первому разведению.
Если в каждой из двух чашек, отобранных для подсчета колоний, содержится их менее 15, то приближенное количество микроорганизмов в 1 г продукта (N_E) рассчитывают по формуле:
гамма - среднее арифметическое колоний, подсчитанных в указанных двух чашках;
d - коэффициент разбавления исходной суспензии.
Если две чашки не содержат колоний на уровне исходной суспензии, то результаты выражают следующим образом:
- менее 1/d микроорганизмов в 1 г, где d - коэффициент разбавления исходной суспензии.
Доверительный интервал, характеризующий статистическое распределение микроорганизмов в пробе, рассчитывают в соответствии с ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований".
5.2. Исследование воды поверхностных водоемов и обитающих в ней гидробионтовВоду и гидробионтов исследуют качественным и количественным методами при проведении санитарно-эпидемиологического расследования.
5.2.1. Качественный анализ воды
Исследование воды отличается от схемы анализа пищевых продуктов, приведенной на рис. 1, только на первом этапе. К 1,0 л исследуемой воды добавляют основной 10%-й раствор пептона, приготовленный из пептона основного сухого (ФСП 42-002-621-2801) до 1%-й концентрации. При необходимости ингибиции посторонней микрофлоры используют пептонную воду с теллуритом калия или препаратом "Прогресс", или другие препараты с аналогичными свойствами, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке (п. 7.2.1.4). Посевы инкубируют 18 - 20 ч при 37 °С. Дальнейшие этапы исследования воды совпадают с этапами исследования пищевых продуктов (рис. 1).
5.2.2. Количественное исследование воды
Воду исследуют в объемах 50, 10 и 1 мл в трех параллельных пробах. Объемы воды 10 мл и 1 мл засевают в 50 мл 1%-й пептонной воды с 3% NaCl (п. 7.2.1.3), а в пробы объемом 50 мл добавляют 5 мл основного раствора пептона. Дальнейшее исследование всех проб проводят по схеме качественного анализа пищевых продуктов, представленной на рис. 1. По окончании идентификации выделенных культур подсчитывают число проб, из которых выделены парагемолитические вибрионы (положительный результат). В зависимости от различных комбинаций положительных и отрицательных результатов определяют наиболее вероятное число (НВЧ) парагемолитических вибрионов в 100 мл воды по таблицам Swaroop, опубликованным в методических указаниях МУК 4.2.671-97 "Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды".
5.2.3. Исследование гидробионтов
Доставленные в лабораторию гидробионты исследуют по схеме, представленной на рис. 1.
5.3. Оценка результатов исследования объектов окружающей средыПри контроле пищевых продуктов на этапах их производства и реализации оценивают соответствие полученных результатов гигиеническим критериям их безопасности, предусмотренным санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
В случае санитарно-эпидемиологического расследования вспышек, обусловленных парагемолитическими вибрионами, культуры этих микроорганизмов, выделенных из продуктов, морской воды и обитающих в ней гидробионтов изучают по тестам внутривидовой дифференциации. Доказательством роли объектов внешней среды, контаминированных парагемолитическими вибрионами, в возникновении заболевания является:
- обнаружение в объектах окружающей среды и от больных людей Канагава-позитивных V. parahaemolyticus;
- выделение от больных, из пищевых продуктов, морской воды и обитающих в ней гидробионтов вибрионов идентичных серологических групп.
Индекс парагемолитических вибрионов в воде морских прибрежных зон должен быть не выше 1000 КОЕ в 1 л в местах рекреации и 500 КОЕ в 1 л в местах водозабора. В сырых гидробионтах с учетом возможного использования их в пищу в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" допускается присутствие V. parahaemolyticus в количестве 100 КОЕ в 1 г. Превышение этих показателей позволяет оценить эпидемическую обстановку в плане возможного распространения инфекции как опасную.
Объем и характер санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий в каждом конкретном случае с учетом полученных результатов определяют эпидемиологи и гигиенисты.