"ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ИЗМЕРЕНИЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО СОПРОТИВЛЕНИЯ (ИМПЕДАНСА) ДЛЯ САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ. 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.1111-02" (утв. Главным государственным санитарным врачом от 26.02.2002)

4. Проведение анализа

Исследование проводится по микробиологическим показателям качества питьевой воды, регламентированным СанПиН 2.1.4.1074-01 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества".

Определяемые показатели:

1. Общее число микроорганизмов в 1 мл.

2. Общие колиформные бактерии в 100 мл.

3. Термотолерантные колиформные бактерии в 100 мл.

4. Споры сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл.

5. Колифаги в 100 мл.

Отбор, хранение и транспортирование проб для исследования, а также подготовка их к анализу и методика работы при использовании мембранных фильтров проводятся в соответствии с требованиями МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".

4.1. Определение общего числа микроорганизмов

1. Питательная среда: BiMedia 001A, приготовленная в соответствии с требованиями инструкции изготовителя.

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 °C на приборе "Бак Трак".

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) - 24 ч.

Масштаб измерений (Scale):

- М-параметр 0 - 50%;

- Е-параметр 0 - 50%.

Время задержки (Delay) - 1 ч.

3. Установка пороговых значений (Thresholds):

3.1. В случае использования калибровочного файла для исследования питьевой воды параметры пороговых значений вносятся автоматически (имеется коммерческий калибровочный файл для исследования питьевой воды - WATER.COR).

3.2. При отсутствии калибровочного файла одновременно с посевом исследуемого образца воды на среду BiMedia 001A производится определение общего количества бактерий классическим методом на чашках Петри в соответствии с требованиями МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".

Наименования рекомендуемых для использования в данном случае питательных сред приведены в разделе 6 данных Методических указаний.

Результаты, полученные при классическом методе исследования (KOE/CFU в 1 мл), вносят в соответствующий файл (MAIN MENU/DATA FUNCTION/ENTER VALUES). Основные этапы создания калибровочного файла рассмотрены в разделе 5 данных указаний.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 001A.

5. Внести 1 мл исследуемого образца воды в измерительную ячейку с 9 мл питательной среды.

6. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

7. Для контроля среды используют одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 001A (без инокулята).

8. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерение.

9. После того, как каждая позиция блока будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Бак Трак".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

При пересечении порогового значения происходит автоматический подсчет численности микроорганизмов в исследуемом образце воды.

Результат определения KOE (CFU) выдается автоматически в виде количества микроорганизмов в 1 мл исследуемого образца воды.

Учет результатов проводится по М-параметру.

4.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

Исследование может проводиться одним из трех методов:

1) мембранной фильтрации с последующим тестированием на микробиологическом экспресс-анализаторе "Бак Трак";

2) титрационным с предварительным этапом накопления бактерий в жидкой питательной среде;

3) прямого измерения с использованием измерительных ячеек прибора "Бак Трак" объемом 100 мл.

4.2.1. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод)

Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из установленного объема анализируемой пробы воды и дальнейшем определении показателя на приборе "Бак Трак". Используется метод мембранных фильтров в соответствии с МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".

1. Среда BiMedia 160B <*>, приготовленная в соответствии с требованиями инструкции изготовителя.

<*> Возможно использование питательной среды BiMedia 160C при необходимости определения индолообразования.

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 °C на приборе "Бак Трак".

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Время исследования (Duration) - 24 ч.

Масштаб измерений (Scale):

- М-параметр 0 - 50%;

- Е-параметр 0 - 50%.

Время задержки (Delay) - 1 ч.

3. Установка пороговых значений (Thresholds):

3.2. В отсутствии калибровочного файла одновременно с посевом исследуемого образца воды на среду BiMedia 160B производится определение наличия колиформных бактерий классическим методом мембранных фильтров в соответствии с МУК 4.2.1018-01.

Результаты, полученные при классическом методе исследования, вносят в соответствующий файл (MAIN MENU/DATA FUNCTION/ENTER VALUES). Основные этапы создания калибровочного файла рассмотрены в разделе 5 данных указаний.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 160B.

5. Поместить мембранный фильтр исследуемого образца воды в измерительную ячейку с 10 мл среды.

6. Для контроля среды используют измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 160B.

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерение.

8. После того, как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Бак Трак".

При наличии в исследуемом образце воды единичных клеток колиформных бактерий изменение сигнала импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру за период времени менее 16 часов.

При положительном результате наблюдается также изменение цвета питательной среды: исходный пурпурный цвет среды меняется на желтый.

При использовании калибровочного файла результат исследования выдается автоматически в виде количества колиформных бактерий в исследуемом объеме воды.

Для постановки оксидазного теста и определения ферментации лактозы при (44 +/- 0,5) °C с целью подтверждения наличия или отсутствия термотолерантных колиформных бактерий в исследуемой пробе из ячеек с признаками роста колиформных бактерий делают высев петлей на чашки Петри со средой Эндо. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 +/- 2 часов.

Постановка тестов проводится в соответствии с требованиями МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".

4.2.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий прямым методом с использованием измерительных ячеек объемом 100 мл

1. Концентрированная среда BiMedia 160B (5-кратной концентрации) <*>.

<*> Для приготовления концентрированной среды навеска сухого препарата среды увеличивается в 5 раз, а объем дистиллированной воды остается прежним.

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 °C на приборе "Бак Трак".

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) - 24 ч.

Масштаб измерений (Scale):

- М-параметр 0 - 50%;

- Е-параметр 0 - 50%.

Время задержки (Delay) - 1 ч.

3. Установка пороговых значений (Thresholds):

3.2. В отсутствии калибровочного файла одновременно с посевом исследуемого образца воды на среду BiMedia 160B производится определение колиформных бактерий классическим методом мембранных фильтров в соответствии с МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".

Результаты, полученные при классическом методе исследования, вносят в соответствующий файл (MAIN MENU/DATA FUNCTIONS/ENTER VALUES). Основные этапы создания калибровочного файла рассмотрены в разделе 5 данных указаний.

4. Поместить 100 мл исследуемого образца воды в измерительную ячейку прибора объемом 100 мл.

5. Добавить в каждую измерительную ячейку по 20 мл концентрированной среды BiMedia 160B.

6. Для контроля среды используют одну измерительную ячейку со 100 мл стерильной дистиллированной воды и 20 мл концентрированной среды BiMedia 160B.

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерения.

При наличии в исследуемом образце воды единичных клеток колиформных бактерий изменение сигнала импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру менее чем за 16 часов.

При положительном результате наблюдается также изменение цвета питательной среды с исходного пурпурного до желтого.

Из ячеек с признаками роста колиформных бактерий делают высев петлей на чашки Петри со средой Эндо для постановки оксидазного теста и определения ферментации лактозы при (44 +/- 0,5) °C с целью подтверждения наличия или отсутствия термотолерантных колиформных бактерий в исследуемой пробе. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Постановка тестов проводится в соответствии с МУК 4.2.1018-01.

4.2.3. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Определение колиформных бактерий титрационным методом проводится в соответствии с МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды" на приборе после этапа подращивания засеянных объемов пробы анализируемой воды в средах накопления.

Сущность метода заключается в посеве определенных объемов анализируемой пробы воды в жидкую питательную среду для накопления бактерий с последующим высевом в измерительную ячейку прибора.

1. Среда BiMedia 160B, приготовленная в соответствии с требованиями инструкции изготовителя.

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 °C на приборе "Бак Трак".

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) - 24 ч.

Масштаб измерений (Scale):

- М-параметр 0 - 50%;

- Е-параметр 0 - 50%.

Время задержки (Delay) - 1 ч.

3. Установка пороговых значений:

Пороговые значения (Thresholds):

- М-параметр 5%;

- Е-параметр 10%.

Проводить учет результатов по М-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) - 3 ч.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 160B.

5. Внести 1 мл из каждого объема с признаками роста в среде накопления в 9 мл среды BiMedia 160B.

6. Для контроля среды использовать одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 160B (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерения.

При наличии в засеянных после накопления объемах колиформных бактерий сигнал импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру в течение 3 ч.

При положительном результате наблюдается также изменение цвета питательной среды с исходного пурпурного на желтый.

Для постановки оксидазного теста и определения ферментации лактозы при (44 +/- 0,5) °C с целью подтверждения наличия или отсутствия термотолерантных колиформных бактерий в исследуемой пробе из засеянных объемов с признаками роста в среде накопления делают высев петлей на среду Эндо. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 20) ч.

Постановка тестов проводится в соответствии с МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".

Для ускорения получения результатов на присутствие термотолерантных колиформных бактерий допустимо проводить высев 1 мл из объема среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование, в измерительную ячейку "Бак Трак" с 9 мл среды BiMedia 160B и инкубировать при режиме (44 +/- 0,5) °C по вышеописанному протоколу измерения.

Учет результатов титрационного метода ведется в соответствии с МУК 4.2.1018-01, раздел 8.3.5.

4.3. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий

Сущность метода заключается в концентрировании определенного объема исследуемого образца воды с использованием мембранных фильтров и последующем тестировании на приборе "Бак Трак".

1. Среда BiMedia 660A (готовится в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя).

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 43 °C на приборе "Бак Трак".

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) - 24 ч.

Масштаб измерений (Scale):

- М-параметр 0 - 50%;

- Е-параметр 0 - 50%.

Время задержки (Delay) - 1 ч.

Пороговые значения (Thresholds):

- М-параметр 5%;

- Е-параметр 10%.

Проводить учет результатов по М-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) - 23 часа.

Определение сульфитредуцирующих клостридий необходимо проводить, используя измерительные ячейки для анаэробов.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл питательной среды BiMedia 660A.

4. Отфильтровать соответствующее количество исследуемого образца воды (20 мл), в котором не допускается наличия спор сульфитредуцирующих клостридий, и поместить фильтр в измерительную ячейку со средой.

5. Для контроля питательной среды используют одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 660A.

6. Поместить измерительные ячейки с образцами исследуемых проб воды и контролем питательной среды в штатив и прогреть на водяной бане при температуре (75 +/- 5) °C в течение 15 мин.

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерения.

Учет результатов

Образец загрязнен спорами сульфитредуцирующих бактерий, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 23 часов.

При положительном результате на стенках измерительной ячейки должен обнаруживаться выпавший осадок черного цвета.

Примечания. Определение возможно проводить, используя обычные измерительные ячейки и парафиновое масло.

Для этого необходимо добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл питательной среды BiMedia 660A и 1 мл парафинового масла (как покрывающий слой) и автоклавировать ячейки с внесенной в них питательной средой и парафиновым маслом (крышки должны быть приоткрыты!).

4.4. Прямой метод определения колифагов

Определение колифагов в воде проводится в измерительных ячейках объемом 100 мл.

1. Среда BiMedia 001A десятикратной концентрации <*>.

<*> Для приготовления концентрированной среды навеска сухого препарата среды увеличивается в 10 раз, а объем дистиллированной воды остается прежним.

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 °C на приборе "Бак Трак".

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) - 24 ч.

Масштаб измерений (Scale):

- М-параметр 0 - 50%;

- Е-параметр 0 - 50%.

Время задержки (Delay) - 1 ч.

Пороговые значения (Thresholds):

- М-параметр 5%;

- Е-параметр 10%.

Учет результатов проводится по М-параметру.

3. Отфильтровать 100 мл исследуемой пробы воды через фильтр для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм.

4. Фильтрат поместить в измерительную ячейку с 10 мл концентрированной среды BiMedia 001A.

5. Внести 1 мл, 0,1 мл и 0,01 мл свежей ночной культуры чувствительного к фагу штамма Е.coli <*> в измерительные ячейки с отфильтрованными образцами воды.

<*> Наименование тест-культуры и подготовка ее для использования в методике определения колифагов указаны в соответствующих разделах МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".

6. Для контроля использовать измерительные ячейки со 100 мл стерильной воды + 10 мл концентрированной среды BiMedia 001A + ночная культура чувствительного к фагу штамма Е.coli (1 мл, 0,1 мл, 0,01 мл).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерение.

8. После того, как каждая позиция блока будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Бак Трак".

Измерение начнется автоматически через 1 час после загрузки ячеек в прибор.

9. Оценка результатов:

- при отсутствии колифагов в воде время детекции импеданса (IDT) будет одинаковым как для исследуемого, так и для контрольного образца (при сравнении одинакового количества внесенной культуры Е.coli);

- при наличии колифагов в воде время детекции импеданса (IDT) для исследуемых образцов будет больше по сравнению с контролем (при сравнении одинакового количества внесенной культуры Е.coli). Изменится также форма кривой импедансного сигнала.

Примечание. Использование различных количеств тест-культуры Е.coli рекомендуется только для начального этапа отработки и нахождения оптимальной плотности культуры. В дальнейших исследованиях возможно использование лишь оптимального количества вносимой культуры. Рекомендуется не превышать показатель 100 - 1000 клеток Е.coli в измерительной ячейке.