"ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

6. Методы изучения свойств холерных вибрионов

6.1. Серологические методы

Принадлежность холерных вибрионов к О1 или О139 серогруппе определяют в слайд-агглютинации или развернутой реакции агглютинации с холерными агглютинирующими сыворотками О1, Инаба, Огава, РО и с холерной сывороткой О139 серогруппы в соответствии с инструкциями по применению препаратов, а также в других реакциях с иммуноглобулиновыми препаратами, предназначенными для ускоренной диагностики холеры и идентификации возбудителя.

Слайд-агглютинацию ставят на обезжиренном стекле, помещенном в чашку Петри или на дне самой чашки, используя подозрительную на холерный вибрион колонию и (или) агаровую 12 - 18-часовую культуру и сыворотки О1 серогруппы в разведении 1:50 - 1:100. Сыворотку О139 разводят в соответствии с указанием на этикетке. Реакцию обязательно сопровождают контролями культуры в 0,9%-м растворе хлорида натрия.

Развернутую реакцию агглютинации ставят и учитывают по общепринятой методике в соответствии с инструкцией по применению диагностических сывороток.

Для исключения спонтанной агглютинации рекомендуется ставить развернутую реакцию в 0,3%-м растворе NaCl.

Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3%-м раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине диагностического титра. Суспензию изучаемой культуры готовят в этом же растворе концентрацией 3 х 10(9) - 5 х 10(9) м.к./мл в объеме 8 - 10 мл. Взвесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1,0 - 1,5 ч. В реакции используют поверхностный слой микробной взвеси, разведенной 0,3%-м раствором натрия хлорида до концентрации 1 млрд. м.к./мл, добавляя ее по 0,5 мл во все разведения сыворотки и контроль культуры (0,5 мл 0,3%-го раствора натрия хлорида + 0,5 мл взвеси культуры). Учет и оценка результатов аналогичны основному варианту развернутой реакции.

Флюоресцентно-серологический метод (МФА - метод флюоресцирующих антител)

Метод дает возможность ускоренно идентифицировать выделенную культуру, а также выявить возбудителя холеры О1 и О139 серогруппы при содержании его в исследуемом материале не менее чем 10(5) м.к./мл. Исследованию подлежат выделенная культура, нативный материал (испражнения и рвотные массы) и материал после подращивания.

Порядок приготовления мазков, обработка их флюоресцирующими иммуноглобулинами, микроскопия и оценка результатов, являющиеся общими для всех бактерий, описаны в "Наставлениях по применению иммуноглобулинов диагностических флюоресцирующих холерных адсорбированных лошадиных сухих".

Положительный результат может быть получен через 1,5 - 2,0 ч от начала исследования.

При просмотре мазков, обработанных иммуноглобулином холерным флюоресцирующим, особое внимание следует обращать на морфологию светящихся микробов, т.к. в отдельных случаях в мазках из испражнений здоровых людей может наблюдаться свечение микроорганизмов, отличающихся по морфологии от вибрионов (грубые крупные палочки, кокки).

Для устранения неспецифического свечения целесообразно использовать в качестве "гасителя" бычий альбумин, меченый родамином. Методика его использования описана в "Инструкции по применению альбумина бычьего, меченого родамином, сухого".

Реакция иммобилизации вибрионов под влиянием специфических холерных сывороток О1 и О139 серогрупп (РИВ)

Метод дает возможность обнаружить возбудителя в течение нескольких минут при концентрации его в исследуемом материале не менее 10(5) м.к./мл. На предметное стекло пипеткой или петлей наносят 2 капли испражнений, рвотных масс или поверхностного слоя среды обогащения. Первую каплю накрывают покровным стеклом (контроль), ко второй добавляют каплю О1 сыворотки в разведении 1:50, перемешивают и также накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю смотрят под микроскопом при увеличении х400 - 600, используя фазово-контрастное устройство или конденсор

темного поля.

При наличии в исследуемом образце холерных вибрионов в первой капле наблюдают характерную подвижность, во второй - иммобилизацию отдельных микробных клеток и образование неподвижных микроагглютинатов немедленно или в течение 1 - 2 мин. В случае неспецифического взаимодействия с диагностическими сыворотками наблюдается образование мелких подвижных конгломератов при активной подвижности отдельных клеток.

Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15 - 20 мин. от начала исследования нативного материала. При отрицательном результате исследование повторяют после подращивания в 1%-й пептонной воде.

В случае отрицательного результата необходимо провести аналогичное исследование с холерной сывороткой О139 серогруппы, которую разводят 1:5.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием диагностикума эритроцитарного холерного иммуноглобулинового

Порядок подготовки материала, ингредиентов, постановки реакции и ее учет изложены в "Инструкции по применению диагностикума эритроцитарного холерного антительного иммуноглобулинового", прилагаемой к препарату.

6.2. Биохимические свойства

Биохимическую активность холерного вибриона изучают, используя коммерческие среды и тест-наборы или среды лабораторного приготовления, рецептура которых изложена в разделе 7.

Определение индофенолоксидазы

а) С помощью реактивов.

Реактивы: 1%-е водные растворы диметил-пара-фенилендиамина, тетраметил-пара-фенилендиамина (гидрохлорида), этилоксиэтил-пара-фенилендиамина серно-кислого (из набора для обработки бумаги "фотоцвет") и пара-аминодиметиланилина (гидрохлорида или оксалата) в сочетании с 1%-м спиртовым раствором альфа-нафтола или без него.

Реактивы должны быть бесцветными, их следует хранить во флаконах из темно-коричневого стекла со стеклянной пробкой без доступа света в холодильнике. В случае помещения реактива во флаконы из светлого стекла их следует обернуть алюминиевой фольгой или темной бумагой.

Постановка пробы:

на поверхность 18-часовой агаровой культуры, подозрительной колонии или полусливного роста на щелочном агаре наносят 1 каплю 1%-го водного раствора одного из указанных реактивов. Положительная реакция на индофенолоксидазу - ярко красная окраска культуры через 20 - 30 с.

При использовании двухкомпонентной реакции (в сочетании с альфа-нафтолом) в положительных случаях - синее окрашивание культуры в течение 1 - 2 мин.

б) Для постановки пробы на оксидазу можно использовать тест-систему ОКСИ-тест или специальные бумажки из набора СИБ, MTC-V или пропитать помещенную в чашку Петри полоску фильтровальной бумаги 2 - 3 каплями 1%-го водного раствора одного из реактивов. Культуру наносят на полоску смоченной реактивом бумаги платиновой петлей (но не хромникелевой), стеклянной или деревянной палочкой и размазывают в виде небольшого пятнышка. Через 10 - 30 с появляется пурпурно-красное окрашивание, свидетельствующее о положительной реакции.

Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на индофенолоксидазу дают вибрионы, аэромонады, псевдомонады, плезиомонады, а отрицательную - все энтеробактерии.

Не следует ставить пробу на оксидазу с культурами на полиуглеводных средах, а также с колониями на элективных средах (СЭДХ и TCBS).

Учитывая возможную нестойкость реактивов и различную способность вибрионов к образованию оксидазы на различных питательных средах, пробу обязательно сопровождают положительными и отрицательными контролями соответственно с культурами вибрионов или псевдомонад и энтеробактерий, выращенными на используемом в лаборатории питательном агаре.

Определение типа расщепления глюкозы (тест Хью-Лейфсона)

В две пробирки со средой Хью-Лейфсона засевают уколом в столбик изучаемую культуру. Поверхность среды в одной из пробирок покрывают 0,5 - 1,0 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют от 1 до 4 суток при температуре (37,0 +/- 0,5) °С. Окисление определяют по желтой окраске среды только в аэробных, ферментацию - в аэробных и анаэробных условиях роста. Вибрионы расщепляют глюкозу по ферментативному типу.

Определение декарбоксилазной и дигидролазной активности

В пробирки со средами, содержащими лизин, орнитин, аргинин и контрольную среду без аминокислот, засевают по полной петле 18-часовой культуры и заливают 0,5 - 1,0 мл стерильного вазелинового масла. Инкубируют посевы при температуре (37,0 +/- 0,5) °С. Учет результатов - ежедневно, при сомнительном результате - наблюдение до 4 суток. В результате ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг рН в кислую сторону, а в дальнейшем при гидролизе аминокислот накапливаются амины, и происходит защелачивание среды.

Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов (глюкоза, лактоза, манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит, крахмал и др.) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с индикатором бромтимоловым синим, Андреде, ВР.

Для посева используют культуру, выращенную в течение 12 - 20 ч на плотной питательной среде или в течение 3 - 4 ч - в жидкой питательной среде. Посевы на средах с углеводами и спиртами инкубируют при (37,0 +/- 0,5) °С и учитывают через 6 - 18 ч.

Для определения диастатической активности кроме среды Гисса с крахмалом может быть использована и среда Кодама. Культуру засевают в среду и также инкубируют при (37,0 +/- 0,5) °С. Через 18 ч в пробирку со средой Кодама добавляют 2 - 3 капли раствора Люголя. При разложении крахмала среда не окрашивается.

Определение протеолитических свойств

В столбик желатины уколом засевают 18-часовую культуру и инкубируют в течение 2 - 3 суток при температуре (22 +/- 0,5) °С или при (37,0 +/- 0,5) °С в течение 18 ч. Перед учетом результатов пробирки помещают в холодильник на 20 мин. При положительном результате желатина остается жидкой, а при отрицательном (и в контрольной пробирке) - затвердевает.

Определение образования индола

Холерные вибрионы при выращивании в средах, содержащих триптофан (пептонная вода, мясопептонный бульон, бульон Хоттингера и др.), расщепляют его с образованием индола, что выявляется с помощью индикаторных бумажек или реактива Эрлиха после инкубирования при температуре (37,0 +/- 0,5) °С в течение 18 ч.

Определение образования сероводорода

Холерные вибрионы не продуцируют фермент тиосульфатредуктазу, т.е. не способны расщеплять неорганические серосодержащие соединения, присутствующие в среде Клиглера и маннозо-сахарозной среде - это является дифференциальным признаком. Однако они так же, как некоторые другие энтеробактерии, продуцируют фермент цистиндесульфогидролазу, за счет которого способны образовывать сероводород из серосодержащих аминокислот, присутствующих в достаточном количестве в бульоне Хоттингера, мясопептонном бульоне, но отсутствующих или содержащихся в незначительном количестве в 1%-й пептонной воде. Поэтому для постановки этого теста культуры выращивают в 1%-й пептонной воде при температуре (37,0 +/- 0,5) °С в течение 18 - 20 ч. Образование сероводорода регистрируют с помощью индикаторных бумажек.

Использование микротест-систем и СИБ

Для определения оксидазы, образования индола и сероводорода, декарбоксилаз лизина, орнитина, дигидролазы аргинина, ферментации углеводов и многоатомных спиртов при идентификации вибрионов можно также использовать Систему индикаторную бумажную (СИБ) и микротест-ситемы для биохимической идентификации вибрионов.

6.3. Выявление способности к биолюминесценции

Изучаемые штаммы засевают в 1%-ю пептонную воду или на пластинки щелочного агара, инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) °С в течение 18 ч. Выросшие культуры просматривают в темной комнате. Свечение наблюдают после 5 - 10-минутной адаптации в темноте.

6.4. Тесты дифференциации биоваров холерных вибрионов О1

Определение чувствительности к диагностическим холерным фагам

В лабораторной диагностике холеры используют бактериофаги диагностические холерные классический и эльтор. При оценке результатов проб с фагами необходимо ориентироваться на диагностический рабочий титр (ДРТ), который обычно обозначают на этикетках. Определение чувствительности к фагам проводят как с цельными препаратами, так и с их 10-кратными разведениями до ДРТ в мясопептонном бульоне. Дифференциальный рабочий титр не ниже 1 х 10(-2).

Для постановки реакции в чашки разливают щелочной агар. После застывания агара и подсушивания его в течение 30 мин. при температуре 37 °С дно чашек делят на квадраты по количеству образцов фагов и 10-кратных разведений фага. В пробирку с 5 мл 0,5 - 0,7%-го питательного агара, расплавленного и охлажденного до 45 °С, добавляют 0,1 - 0,2 мл 3 - 4-часовой бульонной культуры, тщательно смешивают и выливают на поверхность агара. Чашки оставляют при комнатной температуре с приоткрытыми крышками на 30 мин. В центр квадратов наносят штампом-репликатором, стандартной петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой по капле фагов в соответствующих разведениях. После подсыхания капель чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С. Результаты учитывают через 3 - 4 и 18 - 20 ч. Наличие лизиса в виде одного "стерильного" пятна или группы мелких негативных колоний оценивается как положительный результат.

Определение чувствительности к полимиксину В

В расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар (рН 7,2 +/- 0,1) добавляют полимиксин В из расчета 50 единиц на 1 мл среды. После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри. На застывшие агаровые пластинки наносят обычной бактериологической петлей 18- или 3-часовую бульонную культуру. Результаты учитывают после инкубирования посевов при температуре 37 °С в течение 18 ч. Холерные вибрионы биовара cholerae не растут на полимиксиновом агаре, для холерных вибрионов биовара eltor - признак вариабелен.

Постановка реакции гемагглютинации

На предметное стекло в чашке Петри помещают каплю 0,9%-го раствора хлорида натрия и суспендируют в ней петлей 18-часовую агаровую культуру. Затем добавляют каплю 2,5%-й взвеси куриных эритроцитов, трижды отмытых 0,9%-м раствором хлорида натрия. Стекло покачивают до смешивания взвеси эритроцитов и вибрионов. При положительной реакции в течение 1 мин. наступает склеивание эритроцитов. Реакцию сопровождают двумя контролями: а) в каплю 0,9%-го раствора хлорида натрия добавляют каплю 2,5%-й взвеси эритроцитов; б) в капле 0,9%-го раствора хлорида натрия суспендируют испытуемую культуру. Контроли должны быть отрицательными. Для постановки пробы могут быть использованы эритроциты морской свинки.

Постановка реакции Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол)

Испытуемую культуру засевают в глюкозо-фосфатный бульон Кларка и инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) °С в течение 1 - 3 суток. Затем к 1 мл бульонной культуры добавляют 0,6 мл 6%-го спиртового раствора альфа-нафтола и 0,4 мл 40%-го раствора едкого калия. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 1 ч. При положительной реакции среда окрашивается в розовый или ярко-красный цвет.

6.5. Тесты межвидовой дифференциации патогенных для человека вибрионов

Определение галофильности вибрионов

Суточную агаровую культуру исследуемого штамма засевают в 1%-ю пептонную воду с 3% натрия хлорида. Через 3 - 4 ч инкубации при температуре (37,0 +/- 0,5) °С переносят строго по 1 капле выросшей культуры в пептонную воду без NaCl, с 7 и 10% натрия хлорида. Через 18 - 20 ч инкубации оценивают рост культур по помутнению среды.

К негалофильным относятся V. cholerae и V. mimicus, для роста которых достаточны следовые количества соли в среде. Вибрионы остальных видов, за исключением некоторых штаммов V. fluvialis и V. metshnikovii, не растут в 1%-й пептонной воде без добавления натрия хлорида и устойчивы к значительным его концентрациям.

Определение способности вибрионов к росту при разных температурах

Способность вибрионов к росту при температуре 4; 20; 30; 35; 40; 45 и 50 °С выявляют при посеве суточных культур в 1%-ю пептонную воду с 0,5% натрия хлорида для негалофильных вибрионов и с 1,5 - 2,0% натрия хлорида для галофильных вибрионов. Наличие роста оценивают визуально в сравнении с контролем. Наблюдают за посевами ежедневно в течение 2 недель.

Определение нитратредуктазы

а) Суточную агаровую культуру засевают в 1 мл бульона Хоттингера с 0,1% азотно-кислого калия. После 2-х суток инкубации при температуре (37,0 +/- 0,5) °С в посевы добавляют 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях среда сразу же окрашивается в красный цвет.

б) К 1 - 2-суточной культуре в бульоне Хоттингера с 0,1% KNO3 добавляют 3 - 5 капель реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1%-го раствора риванола в дистиллированной воде и 12%-го раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции бульон окрашивается в красный цвет.

Определение бета-галактозидазы

Суточную агаровую культуру засевают на скошенную поверхность агара, содержащего 10% лактозы. Посевы инкубируют 1 - 2 суток при температуре (37 +/- 0,5) °С. Петлю выросшей культуры суспендируют в 0,25 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида, добавляют 0,25 мл водного раствора О-нитрофенил-b-D-галактопиранозита (ONPG) и помещают в термостат при (37 +/- 0,5) °С. Реакцию учитывают через 20 мин., 1, 3 и 24 ч. В положительном случае взвесь приобретает желтую окраску, отрицательном - остается бесцветной.

6.6. Оценка эпидемической значимости холерных вибрионов

6.6.1. Определение гемолитической активности (по Грейгу)

К 1 мл 18 - 24-часовой культуры, выращенной в 4 - 5 мл мясопептонного бульона, добавляют 1 мл 1%-й взвеси трижды отмытых эритроцитов барана в физиологическом растворе. Смесь бульонной культуры и эритроцитов осторожно перемешивают встряхиванием и помещают на 2 ч в термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С, а затем в холодильник до следующего дня. Предварительный учет результатов проводят через 2 ч, окончательный - на следующий день. При положительной реакции наступает полный или частичный лизис эритроцитов (лаковая кровь). В контроле (1 мл бульона + 1 мл взвеси эритроцитов) гемолиз отсутствует. Чистоту опыта следует контролировать путем высева "смеси" на агаровую среду.

Для постановки пробы Грейга может быть использована дефибринированная кровь барана, консервированная борной кислотой или консервантом Алсевера. Консервированные эритроциты сохраняют свои свойства в течение 3-х месяцев. Перед постановкой пробы на гемолиз дефибринированную кровь центрифугируют при 2 - 3 тыс. об./мин. в течение 15 мин., надосадочную жидкость удаляют, а осевшие эритроциты отмывают 0,9%-м раствором хлорида натрия 2 - 3 раза с промежуточным центрифугированием до получения прозрачной надосадочной жидкости. Из отмытых эритроцитов приготавливают 1%-ю взвесь в 0,9%-м растворе хлорида натрия, которую можно хранить при температуре 4 °С 2 - 3 дня и использовать для постановки пробы Грейга описанным выше способом (рецепты консервантов - см. раздел 7).

6.6.2. Определение эпидзначимости холерных вибрионов эльтор комплексным методом - по отношению к диагностическим холерным бактериофагам эльтор ctx+ и ctx- в соответствии с наставлением к препаратам и гемолитической активности

Методика определения гемолитической активности описана выше.

Для постановки пробы с фагом используют метод агаровых слоев. Испытуемую культуру в объеме 0,5 мл добавляют пипеткой в пробирку с 5,0 мл 0,5 - 0,7%-го агара Мартена рН 7,6 +/- 0,2, расплавленного и охлажденного до 45 °С. После перемешивания все содержимое выливают на подсушенную поверхность агара Мартена рН 7,6 +/- 0,2 в чашку Петри. После застывания слоя агара с культурой на его поверхность наносят цельные фаги эльтор ctx+ и ctx-. После высыхания капель фагов чашки переворачивают агаром вверх и инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) °С.

По лизису фагами и гемолитической активности в пробе Грейга (табл. 6) исследуемые штаммы относят к эпидемически опасным (I группа, вариант 1), эпидемически неопасным (III группа, варианты 6, 7, 8) или требующим дополнительных исследований для заключения об их эпидзначимости (группа II, варианты 2, 3, 4, 5).

Таблица 6

СХЕМА ОЦЕНКИ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ V. CHOLERAE ELTOR ПО ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К БАКТЕРИОФАГАМ ctx+ И ctx- И ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

6.6.3. Определение токсигенности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков

Исследования проводят в лабораториях, имеющих разрешение на экспериментальную работу с микроорганизмами I - II групп патогенности.

Для заражения животных используют 4-часовую агаровую культуру, выращенную при температуре (37,0 +/- 0,5) °С или 18-часовую - при температуре (20,0 +/- 1,0) °С. Необходимо использовать две заражающие дозы: 1 х 10(5) и 1 х 10(7) м.к., которые вводят внутрикишечно в объеме по 0,2 мл двум кроликам. Заражающую дозу контролируют путем высева на две чашки щелочного агара 0,1 мл взвеси из разведения 1 х 10(3) м.к./мл. Кроликов 10 - 12-дневных массой 130 - 160 г фиксируют к станку брюшком вверх, выстригают шерсть на операционном поле и смазывают его йодом. Дают эфирный или внутримышечно тиопенталовый наркоз (0,2 мл 1%-го раствора на 100 г массы). Делают разрез длиною 1 см по средней линии живота на уровне пупка. Извлекают петлю тонкого кишечника на длинной брыжейке, фиксируют с помощью мягкого пинцета и вводят взвесь вибрионов. Петлю погружают в брюшную полость, брюшную стенку и кожу послойно зашивают. Шов смазывают йодом. Оперированных крольчат кормят с помощью шприца молоком и наблюдают 48 ч. Всех погибших и умерщвленных через 48 ч животных вскрывают и делают высев содержимого кишечника на чашки щелочного агара. Наиболее выраженные изменения наблюдаются в толстом кишечнике, который растянут бесцветной или светло-желтой прозрачной, или слегка опалесцирующей жидкостью. Слепая кишка и прилегающие отделы толстого кишечника могут быть настолько растянуты, что сквозь них видны подлежащие петли кишечника, что создает видимость полной прозрачности кишечного содержимого. Тонкий кишечник расширен и также заполнен полупрозрачным содержимым. Описанные изменения характерны для "синдрома холерогенности", наблюдаемого при заражении эпидемически опасными, содержащими ген холерного токсина штаммами.

Токсигенные (содержащие ген холерного токсина) штаммы холерных вибрионов вызывают гибель большинства зараженных животных дозами 1 x 10(5) и 1 х 10(7) м.к. в течение первых двух суток с описанным выше типичным "синдромом холерогенности".

Штаммы холерных вибрионов, не содержащие гена холерного токсина, как правило, не вызывают гибели животных и изменений в кишечнике или обусловливают накопление в кишечнике выживших или единичных павших животных мутной, бесцветной или коричневато-желтой жидкости, т.е. развитие энтеропатогенного синдрома, связанного с реализацией других факторов патогенности.

Обязательной проверке на модели кроликов-сосунков при отсутствии возможности определения эпидзначимости другими методами подлежат следующие штаммы V. cholerae О1 и О139 серогрупп.

а) Выделенные от людей:

- гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О139 серогруппы;

- гемолизпозитивные штаммы холерных вибрионов обеих серогрупп;

- гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О1 серогруппы, атипичные по серологическим свойствам и устойчивые к фагам эльтор и ctx+.

б) Выделенные из объектов окружающей среды:

- гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, выделенные при отсутствии эпидосложнений по холере.

6.6.4. Определение генов холерного токсина (ctx АВ) и токсинкорегулируемых пилей (tcp А)

А. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Методом ПЦР проводят определение генов холерного токсина (ctx АВ) и токсинкорегулируемых пилей (tcp А).

В основе ПЦР лежит амплификация (умножение) участка генома, ограниченного парой специфических праймеров, путем многократного копирования при помощи фермента - термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы). Образование в результате реакции фрагментов ДНК ожидаемого размера свидетельствует о наличии в пробе специфической ДНК.

Материал для исследования. Материалом для исследования может быть клинический материал (испражнения, рвотные массы), объекты окружающей среды (вода поверхностных водоемов, смывы с поверхностей, стоки, ил), чистые культуры вибрионов, I и II среда накопления. Первичную подготовку, обеззараживание материала и выделение ДНК проводят в соответствии с МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности".

Подготовка проб для ПЦР. Подлежащие исследованию пробы испражнений или рвотных масс в объеме 1 мл (1 г) помещают в стерильные флаконы и добавляют 0,9 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида, суспендируют встряхиванием и отстаивают в течение 10 мин. Затем для отделения крупных частиц центрифугируют в течение 3 мин. при 5000 g (об./мин.). Надосадочную жидкость центрифугируют в течение 15 мин. при 12000 g (об./мин.), после чего осадок ресуспендируют в 100 мкл дистиллированной воды. Подготовленную таким образом пробу обеззараживают.

Воду из поверхностных водоемов (стоки) центрифугируют в полном объеме (1 л) в центрифужных стаканах емкостью 250 мл в течение 15 мин. при 12000 g (об./мин.). Осадок ресуспендируют в 1000 мкл или 1,5 - 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы обеззараживают.

Подозрительные колонии и чистые культуры, выросшие на плотных питательных средах, суспендируют в 50 мкл дистиллированной воды в микропробирке объемом 1,5 мл, доводя концентрацию до 5 единиц по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-59-86П), что соответствует 1 х 10(9) м.к./мл для вибрионов. Затем готовят 10-кратные разведения взвесей в дистиллированной воде до необходимой концентрации с учетом чувствительности используемой ПЦР-тест-системы и обеззараживают.

При исследовании сред накопления их центрифугируют в течение 15 мин. при 12000 g (об./мин.). Осадок ресуспендируют в 100 мкл дистиллированной воды и обеззараживают.

Обеззараживание проб. Все пробы обеззараживают путем кипячения в течение 30 мин., что обеспечивает инактивацию культур холерных вибрионов согласно пункту 2.8.16 СП 1.3.1285-03.

Выделение ДНК. Из подготовленных и обеззараженных таким образом проб проводят выделение ДНК с помощью сертифицированных наборов для выделения ДНК и согласно прилагаемой к набору инструкции. При исследовании чистых культур этап выделения ДНК опускают, для постановки ПЦР используют обеззараженные кипячением бактериальные взвеси.

Постановка ПЦР. Для постановки ПЦР используют разрешенные комитетом МИБП к применению в практике здравоохранения ПЦР-тест-системы. Работу выполняют согласно прилагаемой к тест-системе инструкции. Амплификацию проводят на программируемых термоциклерах отечественного и зарубежного производства.

Учет результатов ПЦР. Для учета результатов ПЦР используют электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Условия проведения электрофореза, визуализации результатов и их учет отражены в инструкциях к ПЦР-тест-системам.

При этом следует обратить внимание на следующие моменты:

- если в положительном контроле отсутствует специфическая полоса (ошибка в постановке реакции, неправильное хранение или загрязнение реактивов в процессе работы, сбой программы амплификатора) - требуется повторная постановка реакции;

- если в отрицательном контроле выявляется специфическая полоса на уровне положительного контроля (контаминация реактивов положительной ДНК или продуктами амплификации) - необходимо поставить дополнительные отрицательные контроли на этапе постановки ПЦР. Если результат повторяется - необходимо сменить реактивы.

Наличие полос ампликонов, располагающихся выше или ниже контрольной полосы, является неспецифическим ответом, и результат реакции оценивается как отрицательный.

6.7. Оценка антибиотикочувствительности

Для оценки антибиотикочувствительности холерного вибриона используют диско-диффузионный метод и методы серийных разведений в агаре и бульоне.

Методы и критерии оценки антибиотикочувствительности холерного вибриона разработаны и стандартизованы для указанных методов и ограниченного перечня антибиотиков: ампициллина, тетрациклина, доксициклина, ко-тримоксазола, хлорамфеникола.

Для оценки чувствительности холерного вибриона к другим антибиотикам, прежде всего к фторхинолонам, временно предлагается использовать методы и критерии оценки, разработанные для микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. В пользу возможности такого допущения говорит тот факт, что методы и критерии, разработанные для перечисленных выше антибиотиков, полностью совпадают с таковыми для семейства Enterobacteriaceae.

В международной практике основной средой, используемой во всех методах оценки антибиотикочувствительности, является среда Mueller-Hinton (агар и бульон). Рассматриваемые в последующих разделах критерии величины МПК, позволяющие отнести исследуемые микроорганизмы к одной из категорий: "чувствительные", "устойчивые" или "промежуточные", разработаны именно для среды Mueller-Hinton.

Следует признать возможность использования для оценки антибиотикочувствительности и других сред (например, АГВ) в том случае, если они удовлетворяют требованиям, изложенным в разделе 6.7.3. Контроль качества питательных сред для определения антибиотикочувствительности с учетом соответствующих требований проводят в лабораториях учреждений, имеющих необходимые для этого референтные штаммы микроорганизмов. Указанные учреждения ежегодно информируют курируемые лаборатории о возможности использования для этих целей конкретных питательных сред с указанием номера серий и даты выпуска или снабжают их готовыми партиями сред.

6.7.1. Методы серийных разведений

Постановка методов серийных разведений для оценки антибиотикочувствительности включает следующие этапы:

- приготовление растворов антибиотиков;

- приготовление питательных сред с антибиотиками;

- приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция;

- инкубация;

- учет и интерпретация результатов.

Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений является приготовление растворов антибиотиков.

Приготовление растворов антибиотиков

Различают основные растворы антибиотиков - пригодные для хранения и рабочие - используемые "ex tempore" для приготовления питательных сред.

Для приготовления основных растворов антибиотиков предпочтительно использовать субстанции препаратов с известной активностью, допускается использование готовых инъекционных лекарственных форм препаратов, оральные лекарственные формы не пригодны. Для приготовления навесок антибиотиков необходимо использовать аналитические весы или другие равного класса точности.

Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000,0 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности.

В связи с тем, что антибактериальные препараты существенно различаются по растворимости, в ряде случаев возникает необходимость использовать разные вещества для первичной солюбилизации препаратов (растворители) и для доведения их до заданной концентрации (разбавители). В тех случаях, когда растворители и разбавители являются разными веществами, для солюбилизации антибиотика необходимо использовать минимально возможное количество растворителя.

Отличные от воды растворители и разбавители для отдельных антибиотиков приведены в табл. 7. Основные растворы необходимо хранить при температуре не выше - 20 °С (сроки хранения отдельных антибиотиков при этой температуре существенно различаются). Оптимальными условиями для хранения основных растворов антибиотиков является температура -60 °С и ниже, длительность не более 6 месяцев.

Таблица 7

РАСТВОРИТЕЛИ И РАЗБАВИТЕЛИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОСНОВНЫХ РАСТВОРОВ АНТИБИОТИКОВ

С целью предотвращения конденсации влаги извлеченные из морозильника флаконы с основными растворами антибиотиков, прежде чем открыть необходимо выдержать до достижения ими комнатной температуры.

Размороженные основные растворы должны быть использованы для приготовления рабочих растворов, их повторное замораживание не допускается.

Из основных растворов антибиотиков готовят рабочие двукратные концентрации. За основу берется конечная концентрация антибиотика в питательной среде, равная 1,0 мкг/мл (более высокие - 2, 4, 8 и т.д.; более низкие - 0,5; 0,25; 0,125 и т.д.). Реальные концентрации рабочих растворов должны учитывать фактор разбавления раствора антибиотика в питательной среде (обычно 1:10 в плотной среде и 1:2 в жидкой). Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода (метод серийных разведений в агаре) или жидкая питательная среда (метод серийных разведений в бульоне).

Примерный диапазон концентраций антибиотиков, используемых при оценке чувствительности к отдельным препаратам, приведен в табл. 8. В зависимости от целей исследования возможно использовать и иные диапазоны концентраций.

Таблица 8

ДИАПАЗОН КОНЦЕНТРАЦИЙ АНТИБИОТИКОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

6.7.1.1. Методы серийных разведений в агаре

Приготовление питательных сред с антибиотиками

Сухая агаризованная питательная среда растворяется и автоклавируется в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещаются на водяную баню при 48 - 50 °С, где выдерживаются до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара). Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3 - 4 мм.

Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4 - 8 °С в течение 5 суток. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые беталактамные антибиотики, особенно при низких концентрациях, не выдерживают даже указанный срок хранения.

Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков, для контроля роста готовят чашки Петри без антибиотиков.

Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция. Инкубация

Для приготовления суспензии используют 3 - 4-часовую бульонную или суточную агаровую культуру холерного вибриона.

Для получения бульонной культуры отбирают одну или несколько четко изолированных колоний, легким прикосновением петли к центру колонии переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0 - 5,0 мл жидкой неселективной среды, например МПБ. Инкубируют при 37 °С. Приблизительно через 3 - 4 ч инкубации мутность бульонной культуры соответствует 1 - 2 х 10(8) м.к./мл.

Для получения суточных агаровых культур можно использовать только четко изолированные колонии, выросшие на неселективных питательных средах. Взвесь агаровых культур в концентрации 10(9) м.к./мл готовят на стерильном изотоническом растворе или бульонной среде по ОСО ГИСК им. Л.А. Тарасевича - ОСО-42-25-59-86П.

Конечная посевная доза на поверхности питательной среды должна составлять 10(4) м.к. Поскольку коммерческие инокуляторы, штампы-репликаторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3,0 мм переносят 1 - 2 мкл жидкости, концентрация вибрионов в суспензии для инокуляции должна быть 10(7) м.к./мл.

Для получения суспензии требуемой концентрации (10(7) м.к./мл) бульонную культуру следует развести в 10 раз, а взвесь агаровой - в 100 раз. Суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин. после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5 - 8 мм.

После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при 37 °С в течение 16 - 20 ч.

Для контроля качества приготовления суспензий периодически рекомендуется проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на плотную питательную среду.

Важнейшим требованием контроля качества постановки метода является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду для контроля чистоты культуры.

Результат оценки антибиотикочувствительности имеет смысл учитывать только при подтверждении чистоты культуры.

Учет результатов проводят, поместив чашку на темную, не отражающую поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.

При росте нескольких колоний или образовании "прозоны" исследование необходимо повторить, обратив особое внимание на чистоту культуры. В ряде случаев целесообразно получить субкультуру из единичных колоний, выросших на чашках с концентрацией антибиотика выше, чем явная МПК, и провести ее идентификацию.

Интерпретацию результатов проводят с учетом данных, приведенных в табл. 9, с отнесением штаммов к "чувствительным", "устойчивым" или "промежуточным".

6.7.1.2. Метод серийных разведений в бульоне

Наиболее распространен следующий способ постановки метода серийных разведений в бульоне.

Жидкая питательная среда, прошедшая предварительный контроль качества, готовится в соответствии с инструкцией изготовителя.

Рабочие растворы антибиотиков готовят в асептических условиях по схеме, аналогичной для метода серийных разведений в агаре, но в жидкой питательной среде и в концентрациях, вдвое превышающих заданные, затем разливают по 1,0 мл в пробирки.

Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из бульонной или взвеси агаровой культуры путем разведения в жидкой питательной среде до концентрации 10(6) м.к./мл и вносят по 1,0 мл в пробирки с растворами антибиотиков. Таким образом, конечная концентрация микроорганизмов в инкубационной среде будет равна 5 х 10(5) м.к./мл.

Посевы инкубируют при 37 °С в течение 16 - 20 ч.

Учет результатов проводят визуально или спектрофотометрически. За МПК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.

При постановке метода необходимо предусмотреть следующие контроли:

- чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды;

- рост культуры в среде без антибиотика.

Качество постановки метода контролируется периодически с использованием референтных штаммов.

6.7.2. Диско-диффузионный метод

Постановка диско-диффузионного метода включает следующие этапы:

- приготовление питательных сред;

- приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция;

- наложение дисков и инкубация;

- учет и интерпретация результатов.

Для получения достоверных результатов при постановке диско-диффузионного метода необходимо жестко соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков, в противном случае содержание в них антибиотиков может упасть ниже допустимого уровня (прежде всего в результате увлажнения) еще до истечения срока годности. Диски должны храниться при температуре 4 - 8 °С, плотно укупоренными, для дополнительной гарантии защиты от увлажнения во флаконах коммерческих дисков содержится силикагель. Флаконы с дисками следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и выдерживать закрытыми при комнатной температуре, что обеспечит выравнивание температуры дисков и окружающей среды и соответственно предотвратит образование конденсата влаги после открывания флаконов.

Приготовление чашек с питательной средой

К качеству питательных сред для постановки диско-диффузионного метода выдвигаются те же требования, что и к плотным питательным средам для постановки метода серийных разведений в агаре, соответственно используются и те же методы контроля качества.

Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Глубина агарового слоя в чашке должна быть 4,0 мм, что достигается внесением 25 - 30 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм. Размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Свежеприготовленные чашки перед инокуляцией культуры необходимо подсушить при 37 °С в течение 10 - 20 мин. с приоткрытой крышкой.

Чашки с агаром можно хранить в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4 - 8 °С в течение 7 - 10 суток. Перед использованием их также необходимо подсушить в течение 10 - 20 мин. при 37 °С с приоткрытой крышкой.

Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.

Приготовление суспензии и инокуляция

Для приготовления инокулята используют 18 - 20-часовую агаровую или 3 - 4-часовую бульонную культуру холерного вибриона. Суспензию или бульонную культуру доводят до концентрации 10(9) м.к./мл по отраслевому стандартному образцу ГИСК им. Л.А. Тарасевича - ОСО-42-25-59-86П и разводят в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия до конечной концентрации 10(8) м.к./мл.

Приготовленный таким образом инокулят наносят в количестве 1 - 2 мл на поверхность питательной среды, равномерно распределяют по поверхности покачиванием и удаляют избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин.

Наложение дисков и инкубация

Не позднее чем через 15 мин. после инокуляции на поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками.

Диски наносят с помощью автоматического диспенсора или стерильным пинцетом. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15 - 20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Непосредственно после наложения дисков чашки помещают в термостат кверху дном и инкубируют 14 - 18 ч при 37 °С. Увеличение интервала между нанесением дисков на поверхность среды и началом инкубации, а соответственно и пролиферации микроорганизма приводит к "преддиффузии" антибиотика и увеличению диаметра зоны ингибиции роста.

Учет и интерпретация результатов

После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряют с точностью до 1 мм, при этом предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и на едва заметный налет у края зоны. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции, в этом случае необходима повторная идентификация и повторение исследования на антибиотикочувствительность.

При оценке чувствительности к сульфаниламидам и их комбинации с триметопримом границу зоны ингибиции роста следует учитывать на уровне ингибиции роста на 80%. Это связано с тем, что под действием этих препаратов перед полной ингибицией роста возможно завершение 1 - 2-х циклов пролиферации микроорганизма.

Интерпретация результатов производится по табл. 9.

Таблица 9

ПОГРАНИЧНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ДИАМЕТРОВ ЗОН ИНГИБИЦИИ РОСТА (ММ) И ВЕЛИЧИН МПК (МКГ/МЛ) АНТИБИОТИКОВ В ОТНОШЕНИИ ENTEROBACTERIACEAE SPP

6.7.3. Контроль качества питательных сред для определения антибиотикочувствительности

Качество питательной среды является одним из критических параметров для корректной оценки антибиотикочувствительности. Важнейшими показателями качества питательной среды являются концентрации двухвалентных катионов Ca(2+) и Mg(2+), влияющих на активность аминогликозидных антибиотиков и тетрациклинов, а также тимина и тимидина, являющихся антагонистами сульфаниламидных препаратов и триметоприма.

Перед использованием в экспериментах по оценке антибиотикорезистентности каждая новая партия среды (Mueller-Hinton или какой-либо другой) должна пройти контроль качества в соответствии с описанным ниже методом.

А. Определение рН среды

Определение рН среды проводят после автоклавирования и охлаждения до комнатной температуры 25 °С, приемлемый диапазон 7,2 - 7,4. При величине рН среды, выходящей за указанные пределы, возможны существенные изменения в величине МПК.

Б. Контроль катионного состава

Для получения воспроизводимых результатов оценки антибиотикорезистентности питательная среда должна содержать Ca(2+) 20 - 25 мг/л и Mg(2+) 10,0 - 12,5 мг/л.

Наиболее доступным интегральным методом оценки качества сред (как жидких, так и агаризованных) является сопоставление экспериментально полученной величины МПК референтных штаммов микроорганизмов с этим показателем, приведенным в их паспортной характеристике.

Наиболее подходящим штаммом для оценки качества жидких и плотных питательных сред, предназначенных для изучения антибиотикорезистентности, является штамм Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853. Среду следует считать удовлетворительной по качеству, если величина МПК гентамицина находится в пределах 0,5 - 2,0 мкг/мл. Выбор гентамицина для контроля качества связан с тем, что аминогликозидные антибиотики наиболее чувствительны к колебаниям концентрации двухвалентных катионов.

В. Для контроля на наличие антагонистов сульфаниламидных препаратов и триметоприма рекомендуется использовать штамм Enterococcus faecalis АТСС 29212. При величине МПК триметоприма/сульфаметоксазола < 0,5/9,5 мкг/мл среду следует признать удовлетворительной по качеству.

Определение величины МПК антибиотиков (или диаметров зон ингибиции роста) в отношении референтных штаммов в целях контроля качества среды проводят в соответствии с описанными выше методами. Категорическим требованием является использование антибиотиков с предварительно известной активностью.

Таблица 10

ЗНАЧЕНИЯ ВЕЛИЧИН МПК (МКГ/МЛ) ДЛЯ НЫХ ШТАММОВ

Таблица 11

ЗНАЧЕНИЯ ВЕЛИЧИН ДИАМЕТРОВ ЗОН ИНГИБИЦИИ РОСТА (ММ) ДЛЯ НЫХ ШТАММОВ