Законодательная база Российской Федерации

"ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

Биохимическую активность холерного вибриона изучают, используя коммерческие среды и тест-наборы или среды лабораторного приготовления, рецептура которых изложена в разделе 7.

Определение индофенолоксидазы

а) С помощью реактивов.

Реактивы: 1%-е водные растворы диметил-пара-фенилендиамина, тетраметил-пара-фенилендиамина (гидрохлорида), этилоксиэтил-пара-фенилендиамина серно-кислого (из набора для обработки бумаги "фотоцвет") и пара-аминодиметиланилина (гидрохлорида или оксалата) в сочетании с 1%-м спиртовым раствором альфа-нафтола или без него.

Реактивы должны быть бесцветными, их следует хранить во флаконах из темно-коричневого стекла со стеклянной пробкой без доступа света в холодильнике. В случае помещения реактива во флаконы из светлого стекла их следует обернуть алюминиевой фольгой или темной бумагой.

Постановка пробы:

на поверхность 18-часовой агаровой культуры, подозрительной колонии или полусливного роста на щелочном агаре наносят 1 каплю 1%-го водного раствора одного из указанных реактивов. Положительная реакция на индофенолоксидазу - ярко красная окраска культуры через 20 - 30 с.

При использовании двухкомпонентной реакции (в сочетании с альфа-нафтолом) в положительных случаях - синее окрашивание культуры в течение 1 - 2 мин.

б) Для постановки пробы на оксидазу можно использовать тест-систему ОКСИ-тест или специальные бумажки из набора СИБ, MTC-V или пропитать помещенную в чашку Петри полоску фильтровальной бумаги 2 - 3 каплями 1%-го водного раствора одного из реактивов. Культуру наносят на полоску смоченной реактивом бумаги платиновой петлей (но не хромникелевой), стеклянной или деревянной палочкой и размазывают в виде небольшого пятнышка. Через 10 - 30 с появляется пурпурно-красное окрашивание, свидетельствующее о положительной реакции.

Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на индофенолоксидазу дают вибрионы, аэромонады, псевдомонады, плезиомонады, а отрицательную - все энтеробактерии.

Не следует ставить пробу на оксидазу с культурами на полиуглеводных средах, а также с колониями на элективных средах (СЭДХ и TCBS).

Учитывая возможную нестойкость реактивов и различную способность вибрионов к образованию оксидазы на различных питательных средах, пробу обязательно сопровождают положительными и отрицательными контролями соответственно с культурами вибрионов или псевдомонад и энтеробактерий, выращенными на используемом в лаборатории питательном агаре.

Определение типа расщепления глюкозы (тест Хью-Лейфсона)

В две пробирки со средой Хью-Лейфсона засевают уколом в столбик изучаемую культуру. Поверхность среды в одной из пробирок покрывают 0,5 - 1,0 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют от 1 до 4 суток при температуре (37,0 +/- 0,5) °С. Окисление определяют по желтой окраске среды только в аэробных, ферментацию - в аэробных и анаэробных условиях роста. Вибрионы расщепляют глюкозу по ферментативному типу.

Определение декарбоксилазной и дигидролазной активности

В пробирки со средами, содержащими лизин, орнитин, аргинин и контрольную среду без аминокислот, засевают по полной петле 18-часовой культуры и заливают 0,5 - 1,0 мл стерильного вазелинового масла. Инкубируют посевы при температуре (37,0 +/- 0,5) °С. Учет результатов - ежедневно, при сомнительном результате - наблюдение до 4 суток. В результате ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг рН в кислую сторону, а в дальнейшем при гидролизе аминокислот накапливаются амины, и происходит защелачивание среды.

Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов (глюкоза, лактоза, манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит, крахмал и др.) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с индикатором бромтимоловым синим, Андреде, ВР.

Для посева используют культуру, выращенную в течение 12 - 20 ч на плотной питательной среде или в течение 3 - 4 ч - в жидкой питательной среде. Посевы на средах с углеводами и спиртами инкубируют при (37,0 +/- 0,5) °С и учитывают через 6 - 18 ч.

Для определения диастатической активности кроме среды Гисса с крахмалом может быть использована и среда Кодама. Культуру засевают в среду и также инкубируют при (37,0 +/- 0,5) °С. Через 18 ч в пробирку со средой Кодама добавляют 2 - 3 капли раствора Люголя. При разложении крахмала среда не окрашивается.

Определение протеолитических свойств

В столбик желатины уколом засевают 18-часовую культуру и инкубируют в течение 2 - 3 суток при температуре (22 +/- 0,5) °С или при (37,0 +/- 0,5) °С в течение 18 ч. Перед учетом результатов пробирки помещают в холодильник на 20 мин. При положительном результате желатина остается жидкой, а при отрицательном (и в контрольной пробирке) - затвердевает.

Определение образования индола

Холерные вибрионы при выращивании в средах, содержащих триптофан (пептонная вода, мясопептонный бульон, бульон Хоттингера и др.), расщепляют его с образованием индола, что выявляется с помощью индикаторных бумажек или реактива Эрлиха после инкубирования при температуре (37,0 +/- 0,5) °С в течение 18 ч.

Определение образования сероводорода

Холерные вибрионы не продуцируют фермент тиосульфатредуктазу, т.е. не способны расщеплять неорганические серосодержащие соединения, присутствующие в среде Клиглера и маннозо-сахарозной среде - это является дифференциальным признаком. Однако они так же, как некоторые другие энтеробактерии, продуцируют фермент цистиндесульфогидролазу, за счет которого способны образовывать сероводород из серосодержащих аминокислот, присутствующих в достаточном количестве в бульоне Хоттингера, мясопептонном бульоне, но отсутствующих или содержащихся в незначительном количестве в 1%-й пептонной воде. Поэтому для постановки этого теста культуры выращивают в 1%-й пептонной воде при температуре (37,0 +/- 0,5) °С в течение 18 - 20 ч. Образование сероводорода регистрируют с помощью индикаторных бумажек.

Использование микротест-систем и СИБ

Для определения оксидазы, образования индола и сероводорода, декарбоксилаз лизина, орнитина, дигидролазы аргинина, ферментации углеводов и многоатомных спиртов при идентификации вибрионов можно также использовать Систему индикаторную бумажную (СИБ) и микротест-ситемы для биохимической идентификации вибрионов.