Законодательная база Российской Федерации

"ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

Определение чувствительности к диагностическим холерным фагам

В лабораторной диагностике холеры используют бактериофаги диагностические холерные классический и эльтор. При оценке результатов проб с фагами необходимо ориентироваться на диагностический рабочий титр (ДРТ), который обычно обозначают на этикетках. Определение чувствительности к фагам проводят как с цельными препаратами, так и с их 10-кратными разведениями до ДРТ в мясопептонном бульоне. Дифференциальный рабочий титр не ниже 1 х 10(-2).

Для постановки реакции в чашки разливают щелочной агар. После застывания агара и подсушивания его в течение 30 мин. при температуре 37 °С дно чашек делят на квадраты по количеству образцов фагов и 10-кратных разведений фага. В пробирку с 5 мл 0,5 - 0,7%-го питательного агара, расплавленного и охлажденного до 45 °С, добавляют 0,1 - 0,2 мл 3 - 4-часовой бульонной культуры, тщательно смешивают и выливают на поверхность агара. Чашки оставляют при комнатной температуре с приоткрытыми крышками на 30 мин. В центр квадратов наносят штампом-репликатором, стандартной петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой по капле фагов в соответствующих разведениях. После подсыхания капель чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С. Результаты учитывают через 3 - 4 и 18 - 20 ч. Наличие лизиса в виде одного "стерильного" пятна или группы мелких негативных колоний оценивается как положительный результат.

Определение чувствительности к полимиксину В

В расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар (рН 7,2 +/- 0,1) добавляют полимиксин В из расчета 50 единиц на 1 мл среды. После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри. На застывшие агаровые пластинки наносят обычной бактериологической петлей 18- или 3-часовую бульонную культуру. Результаты учитывают после инкубирования посевов при температуре 37 °С в течение 18 ч. Холерные вибрионы биовара cholerae не растут на полимиксиновом агаре, для холерных вибрионов биовара eltor - признак вариабелен.

Постановка реакции гемагглютинации

На предметное стекло в чашке Петри помещают каплю 0,9%-го раствора хлорида натрия и суспендируют в ней петлей 18-часовую агаровую культуру. Затем добавляют каплю 2,5%-й взвеси куриных эритроцитов, трижды отмытых 0,9%-м раствором хлорида натрия. Стекло покачивают до смешивания взвеси эритроцитов и вибрионов. При положительной реакции в течение 1 мин. наступает склеивание эритроцитов. Реакцию сопровождают двумя контролями: а) в каплю 0,9%-го раствора хлорида натрия добавляют каплю 2,5%-й взвеси эритроцитов; б) в капле 0,9%-го раствора хлорида натрия суспендируют испытуемую культуру. Контроли должны быть отрицательными. Для постановки пробы могут быть использованы эритроциты морской свинки.

Постановка реакции Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол)

Испытуемую культуру засевают в глюкозо-фосфатный бульон Кларка и инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) °С в течение 1 - 3 суток. Затем к 1 мл бульонной культуры добавляют 0,6 мл 6%-го спиртового раствора альфа-нафтола и 0,4 мл 40%-го раствора едкого калия. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 1 ч. При положительной реакции среда окрашивается в розовый или ярко-красный цвет.