Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава РФ от 26.03.2001 N 87 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА"

Методические указания предназначены для лабораторных работников и клиницистов дерматовенерологической службы России. Указания посвящены современным методам серо- и ликвородиагностики сифилиса, широко апробированным в научно - исследовательских и лечебно - профилактических учреждениях страны. Представлены новые высоко чувствительные специфичные методики постановки реакций на сифилис. Освещено предназначение различных тестов в качестве отборочных, диагностических и контрольных для оценки эффективности лечения. Описаны принципы реакций, методики их постановки, материально - техническое обеспечение, источники получения ошибочных результатов и мероприятия по технике безопасности при работе с инфекционным материалом.

Организация - разработчик: ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ.

Авторы: докт. биол. наук, проф. Г.А.Дмитриев, докт. мед. наук, проф. В.Н.Беднова, докт. мед. наук Г.Ф.Тимченко, канд. мед. наук Г.А.Киселева, канд. мед. наук Т.И.Милонова, канд. мед. наук О.А.Стоянова, З.П.Акопова.

Для серо- и ликвородиагностики сифилиса в России могут применяться следующие методы:

1. Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР), которая является отборочным тестом при обследовании населения на сифилис. Постановка МР осуществляется с плазмой или инактивированной сывороткой крови. Зарубежные тесты ВДРЛ (VDRL), РПР (RPR) и другие аналогичные МР как по принципу постановки реакции, так и по чувствительности и специфичности.

2. Иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем.

3. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем.

4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ-абс, РИФ-ц, РИФ с капиллярной кровью из пальца. Антиген - патогенная бледная трепонема штамма Никольса.

5. Комплекс серологических реакций на сифилис (КСР), состоящий из реакции связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами, и МР. Поскольку трепонемный антиген является специфическим, КСР относится к диагностическим тестам. В связи с разработкой более чувствительных, специфичных и менее трудоемких реакций стало возможным заменить при постановке КСР реакцию связывания комплемента на ИФА или РПГА также в сочетании с МР.

6. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), в которой в качестве антигена используют патогенные бледные трепонемы штамма Никольса.

РИТ, РИФ, ИФА и РПГА являются высокочувствительными и высокоспецифичными реакциями на сифилис. Они относятся к диагностическим подтверждающим тестам. При этом в связи с простотой постановки и наличием коммерческих тест - систем ИФА и РПГА могут быть и высокоэффективными отборочными тестами.

Ввиду различной чувствительности при разных формах сифилиса, специфичности и сложности постановки каждая из указанных реакций имеет свое предназначение.

Профилактическое обследование населения на сифилис можно проводить с помощью МР, КСР, ИФА и РПГА. Все организационные вопросы по применению данных реакций с этой целью решаются органами здравоохранения на местах в зависимости от местных условий и возможностей.

При получении положительного результата в МР пациент должен обследоваться дерматовенерологом с повторным исследованием крови в любом диагностическом тесте на сифилис.

При профилактическом обследовании на сифилис больных глазных, психоневрологических, кардиологических стационаров, беременных, в частности, направляемых на искусственное прерывание беременности, должны использоваться КСР, ИФА или РПГА.

При обследовании доноров необходимо применять КСР или ИФА или РПГА, но обязательно в сочетании с МР. Постановка двух реакций одновременно обусловлена высокой ответственностью данного исследования.

МР в количественном варианте с экономической точки зрения необходимо использовать в качестве контроля эффективности лечения, заменив ею количественную постановку РСК с кардиолипиновым антигеном.

Вышеуказанные специфические тесты служат для диагностики всех форм сифилиса, в частности, скрытого, а также для распознавания ложноположительных результатов, полученных в МР и КСР. При диагностике скрытого сифилиса целесообразна постановка двух специфических тестов одновременно.

Поскольку ИФА и РПГА являются более высокочувствительными, специфическими и воспроизводимыми тест - системами, которые можно использовать в качестве отборочных и подтверждающих тестов, осуществить до 2006 г. замену комплекса серореакций (КСР) вышеуказанными реакциями при диагностике сифилиса.

Таким образом, последовательность обследования пациентов на сифилис представляется следующим образом:

- при первичном обследовании производится постановка отборочной (скрининговой) реакции микропреципитации (РМП) или ее модификации (RPR- РПР, trUST - ТРАСТ, VDRL - ВДРЛ) в количественном и качественном вариантах и в случае положительного результата - любого специфического подтверждающего трепонемного теста (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ);

- после окончания терапии ставится РМП или ее модификация и по снижению титра судят о динамике инфекционного процесса и эффективности терапии. Подтверждением эффективности проведенной терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года;

- по окончании этого срока осуществляется постановка той же специфической реакции, что и при первичном обследовании. Следует учитывать, что специфические трепонемные тесты могут оставаться положительными (не негативировать) в течение ряда лет, а в отдельных случаях остаются положительными на всю жизнь.

Методика постановки и суть различных модификаций МР, ИФА, РПГА, РИФ, РСК и РИТ подробно описаны в настоящих Методических указаниях.

Впервые детально описаны 6 методов, используемых для серо- и ликвородиагностики сифилиса включающих 15 модификаций. Рекомендована замена РСК при определении эффективности лечения сифилиса МР, что дает экономический эффект. Введена в инструкцию количественная методика постановки РИТ, расширяющая возможности поздних форм сифилиса. Включены методики постановки РСК, РИТ, РИФ-ц и ИФА для ликвородиагностики сифилиса.

Серо- и ликвородиагностика всех форм сифилиса.

Противопоказаний нет.

Оборудование для взятия крови и постановки МР:

- капиллярные пипетки аппарата Панченкова;

- градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл;

- автоматические пипетки на 20-200 мкл;

- наконечники для автоматических пипеток;

- пробирки длиной 8-10 см и 14-15см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные;

- пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см;

- иглы для взятия крови из пальца и вены; шприцы;

- центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин;

- аппарат для встряхивания;

- стерилизатор для кипячения игл, шприцов, инструментов.

Контрольные лиофилизированные сыворотки крови необходимы для установления пригодности эмульсии антигена. Отрицательную и положительную контрольные сыворотки крови используют неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. При отсутствии лиофилизированных сывороток крови используют нативную положительную или смесь положительных в РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции инактивированных сывороток крови, которые разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки реакции сыворотку крови титруют на пластинке с целью подтверждения ранее установленного титра, для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня.

Титрование контрольной сыворотки проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл контрольной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пипеткой, насасывая и выпуская его в лунку 5-6 раз. Затем набирают 90 мкл содержимого второй лунки в пипетку и 90 мкл переносят в третью лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки 90 мкл удаляют. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают в аппарате в течение 5 минут, добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после чего регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/ 2+), используют в качестве слабоположительного контроля. Для получения его делают соответствующее разведение. Например, если слабоположительный результат получен с разведением сыворотки крови 1:8, то для получения контрольной слабоположительной сыворотки крови в пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.

При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения наблюдается равномерное уменьшение величины хлопьев преципитата.

При снижении реактивности хранящейся нативной контрольной сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови можно использовать до тех пор, пока она дает положительный результат (4+) в разведении не ниже 1:2, и слабоположительный результат (2+) в разведении не меньше 1:4. При дальнейшем снижении реактивности употреблявшуюся положительную контрольную сыворотку крови заменяют новой.

При хранении контрольных сывороток крови не допускаются повторные замораживания их и оттаивание, т.к. в этом случае реактивность их снижается.

О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не эмульсии антигена, судят по параллельному титрованию этой сыворотки крови с использованием хранившейся и вновь приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител в МР с обеими антигенными эмульсиями, то считают, что снижение реактивности зависит от хранения контрольной сыворотки крови, если же снижение реактивности наблюдают только при использовании хранившейся эмульсии антигена, то это обусловлено снижением реактивности эмульсии антигена, которую необходимо заменить свежеприготовленной.

Серологические лаборатории кожно - венерологических диспансеров должны снабжать контрольными сыворотками крови лаборатории района, использующие в своей работе экспресс - метод и не имеющие положительных и отрицательных сывороток крови. При отсутствии контрольных сывороток крови реакцию ставить нельзя.

Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации. Нельзя использовать в микрореакции кардиолипиновый антиген, предназначенный для реакции связывания комплемента.

Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность ампулированного антигена. При выпадении кристаллов холестерина их растворяют нагреванием ампул в термостате или водяной бане при 37 град. С или 56 град. С соответственно.

Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают необходимое количество ее на рабочий день или рабочую неделю (на 50 исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку вносят сухой пипеткой не более 2 мл антигена, добавляя его к равному объему 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем центрифугируют при 1000 об/мин до получения прозрачной жидкости, которую удаляют, а к осадку добавляют 3,5 объема (по отношению к взятому антигену) 10% раствора холин - хлорида. Например, если требуемый объем антигена равен 0,5 мл, то для вычисления количества холин - хлорида 0,5 мл умножают на 3,5 и получают 1,75 мл, т.е. необходимый объем холин - хлорида. Пробирку плотно закрывают пробкой и содержимое перемешивают, опрокидывая пробирку, до полного ресуспендирования. Полученная эмульсия готова к употреблению. При необходимости приготовления большого количества эмульсии, ее готовят не в одном флаконе большой емкости, а в нескольких пробирках, внося в каждую из них по 2 мл антигена. Такие объемы обеспечивают лучшее перемешивание антигена, предохраняют его от загрязнений при повторном взятии для постановки реакции, а также от нагревания и действия солнечных лучей.

Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4 град. не более недели, а при добавлении раствора мертиолата - в течение 2 недель. В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 минут и перемешивают ее, опрокидывая пробирку, закрытую пробкой, не менее 30 раз, затем проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови. Применяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой серии антигена проверяют в экспресс - методе одновременно с уже бывшей в работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови. О пригодности антигена судят по величине титров, наблюдаемых при одновременном титровании положительных сывороток крови с новой и проверенной сериями антигенов. Получение близких результатов, т.е. величин титров реагентов, отличающихся на +/-1 разведение, одинаковой выраженности хлопьев преципитата, наблюдаемых в одних и тех же разведениях положительных сывороток крови свидетельствует о пригодности исследуемой серии антигена. Серию антигена бракуют, если одновременное титрование контрольной положительной сыворотки крови с новой серией антигена показывает: а)слабо выраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях сыворотки крови; б) более низкий (на 2-3 разведения) титр реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией; в) наличие преципитата в отрицательных сыворотках крови.

Получение плазмы крови:

Кровь берут из пальца так же, как для исследования скорости оседания эритроцитов (СОЭ). При взятии крови смачивают капилляр аппарата Панченкова 5% раствором цитрата натрия, набрав раствор до метки "25", а оставшийся цитрат натрия выливают в центрифужную пробирку, куда затем вносят три капилляра крови, взятой до метки "К", перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы крови, которую отсасывают автоматической пипеткой для проведения исследования.

Получение инактивированной сыворотки крови: Кровь берут из вены, получают сыворотку крови и инактивируют ее так же, как для РСК.

Методика постановки микрореакции:

Качественную и количественную постановки микрореакции с испытуемой плазмой и инактивированной сывороткой крови следует осуществлять следующим образом.

При использовании качественной методики постановки микрореакции автоматической пипеткой забирают по 90 мкл плазмы или инактивированной сыворотки крови и вносят в лунки, куда затем добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. В каждую лунку вносят плазму или сыворотку крови от одного обследуемого и нумеруют соответственно списку в регистрационном журнале. Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины во встряхивателе (100 качаний в 1 минуту) в течение 5 минут, затем в каждую лунку добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28 град.). Результаты учитывают только после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке крови.

При использовании количественной методики постановки микрореакции в 9 лунок горизонтального ряда пластины, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл исследуемой плазмы или сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают автоматической пипеткой, забирая его и выпуская из нее в лунку 5-6 раз, затем забирают 90 мкл и переносят в третью лунку. Из третьей лунки 90 мкл переносят в четвертую и т. д. по десятую лунку, из которой 90 мкл удаляют. Таким образом получают двукратные разведения плазмы или сыворотки крови 1:2, 1:4, 1:8 и далее до 1:516. В первую лунку изотонический раствор натрия хлорида не приливают, а вносят только 90 мкл плазмы или сыворотки крови, т.е. исследуют цельную плазму или сыворотку крови. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластину встряхивают 5 минут, после чего во все лунки добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида. Через 5 минут регистрируют результаты так же, как при постановке качественной реакции.

Титром преципитинов считают последнее разведение плазмы или сыворотки крови, где обнаружен преципитат. Величина титра указывает на активность процесса, а его снижение во время лечения - на эффективность терапии. Стабильность титров настораживает клиницистов в отношении эффективности терапии, увеличение же их требует пересмотра лечения.

Для получения достоверных результатов следует пользоваться одной и той же серией препарата при обследовании больного в процессе лечения, что относится ко всем реакциям на сифилис.

К моменту снятия леченного больного с учета неспецифические тесты с кардиолипиновым антигеном обычно негативируются, в то время как позитивность специфических реакций может наблюдаться долго после окончания лечения, в связи с чем эти тесты не могут служить критерием излеченности и больные снимаются с учета с положительными результатами РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.

Источники ошибок при постановке МР:

- неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха в капилляре пипеток);

- исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабоположительных;

- неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием;

- бактериальное загрязнение эмульсии;

- нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсии, растворов;

- замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным;

- использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, пластинок, растворов.

Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.

Лаборатории, в которых осуществляется постановка ИФА, должны быть укомплектованы:

- набором автоматических пипеток (микродозаторов), который включает в себя одноканальные пипетки переменного объема, рассчитанные на дозирование 5-40, 40-200 и 200-1000 мкл жидкости, а также 8-канальные пипетки переменного объема на 5-50 (при использовании тест - систем с рабочим разведением образцов 1:100 и 1:200) и 50-300 мкл;

- набором мерной химической посуды;

- термостатом, рассчитанным на поддержание температуры 37 град. С;

- дистиллятором лабораторным для получения дистиллированной воды;

- спектрофотометром планшетным;

- холодильником;

- рН-метром.

Результаты ИФА с сывороткой крови и ликвором при использовании всех тест - систем с автоматическим учетом регистрируют на спектрофотометре для планшетов немедленно после постановки реакции с измерением оптической плотности (ОП) раствора субстрата при длине волны 492 нм.

Выведение спектрофотометра на нулевой уровень ("бланк") осуществляют по воздуху. Учет результатов реакции проводят согласно методике и цифровым данным, изложенным в инструкции по применению, имеющейся в каждом используемом наборе. При автоматическом учете результатов реакции по величине цифровых показателей ОП в лунках с испытуемыми образцами судят о концентрации специфических антител в исследуемой сыворотке крови и ликворе. В связи с этим данный метод оценки результатов называют количественным. При каждой постановке ИФА рассчитывают критическое значение ОП (ОПкрит.) и "серую зону". "Серой зоной" является интервал от ОПкрит. - 10% до ОПкрит. + 10%. Исследуемый образец учитывают как положительный, если ОП данного образца выше "серой зоны", как сомнительный, если ОП находится в пределах "серой зоны", и как отрицательный, если ОП ниже "серой зоны". Так учитывают результаты во всех тест - системах, кроме тест - системы "ЛюисСкрин". В тест - системе "ЛюисСкрин" исследуемая сыворотка расценивается как положительная, если ее ОП превышает ОП отрицательного контроля не менее, чем в 2 раза.

К сожалению, при учете результатов реакции все ИФА тест - системы невозможно привести к единому стандарту. Один и тот же образец может давать в разных тест - системах совершенно разный уровень окрашивания раствора субстрата. Это зависит от конструкции самой тест - системы, используемого антигена, концентрации конъюгата и др., а также от величины ОПкрит. Поэтому более точной оценкой результатов ИФА является титр противотрепонемных антител каждого положительного образца. С целью определения титра производят последовательные 2-кратные разведения испытуемой сыворотки крови, давшей положительный результат. За титр принимают наибольшее разведение сыворотки, дающее положительный результат. Следовательно, титр является количественным показателем уровня специфических антител в данном образце и степени его позитивности. Но следует учитывать, что повторное исследование сыворотки крови должно осуществляться с той же тест - системой, так как титр антител в одном и том же образце может быть различным при использовании разных тест - систем.

При применении тест - системы с визуальным учетом результатов также рекомендуется определение титров противотрепонемных антител в резко положительных сывороточных образцах (4+).

Отрицательной чертой количественного метода исследования с целью определения титра антител в сыворотке крови и ликворе является его неэкономичность. В связи с этим целесообразно использовать другой критерий для характеристики концентрации антител - коэффициент позитивности (КП), равный отношению оптической плотности, полученной для каждого образца, к критической оптической плотности: КП = ОП/ОПкрит. КП у положительных образцов выше 1,1, сомнительных - находится в интервале от 0,9 до 1,1 и отрицательных - ниже 0,9. Определение КП целесообразно проводить при выяснении динамики выработки антител у пациента в процессе наблюдения за ним после лечения сифилиса, при этом обязательно нужно использовать ту же тест - систему, что и до лечения больного. Эта методика не требует дополнительных финансовых затрат и дает представление об эффективности лечения.

При использовании тест - системы иммуноферментной для качественного выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови человека ("АТ-Треп.-ИФТС", г. Ставрополь) возможен только визуальный учет результатов реакции. При резко положительном (4+) результате субстратная смесь имеет темно - коричневый цвет, при положительном (3+) - коричневый цвет, при слабоположительном (2+) - светло - коричневый, при отрицательном (+,-) - светло - бежевый цвет или бесцветна.

Образцы, для которых получен сомнительный результат (соответствующая им ОП находится в пределах "серой зоны" и КП в интервале от 0,9 до 1,1) подлежат повторному анализу. При повторном сомнительном результате рекомендуется анализ с новой порцией крови, взятой через 3-7 дней.

Для ликвородиагностики сифилиса могут быть использованы отечественные тест - системы ИФА, предназначенные для выявления иммуноглобулинов класса О и работающие по первой схеме проведения реакции. В настоящее время такими тест - системами являются:

1. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к Treponema pallidum в сыворотке или плазме крови человека "РекомбиБест антипаллидум" и "РекомбиБест антипаллидум - стрип" производства ЗАО "Вектор - Бест" (п. Кольцово Новосибирской области); 2. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса "ИФА - АНТИ - LUIS" производства НПО "Диагностические системы" (г. Нижний Новгород); 3. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса (Treponema pallidum)Ha основе рекомбинантных белков производства БТК "Биосервис" (г. Москва).

Ликвор в реакцию вводят цельным и неинактивированным. Мутный или с примесью крови ликвор центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость. Перед исследованием ликвор можно сохранять в морозильном отделении холодильника при температуре от -12 град.С до -18 град. С в пробирках под резиновыми пробками или в "эппендорфах" до 1 месяца. Размораживание производят при комнатной температуре. Повторное замораживание и размораживание не допускается.

При исследовании ликвора приготовление рабочих растворов, проведение ИФА и учет результатов осуществляют в соответствии с инструкцией по применению тест - систем, за исключением пунктов, касающихся разведения ликвора и приготовления рабочих растворов конъюгата. Так, исследование ликвора в отличие от исследования сыворотки или плазмы крови проводят в первой фазе реакции при его разведении 1:2 (50 мкл ликвора и 50 мкл раствора для разведения) и во второй фазе реакции с рабочим раствором конъюгата, концентрация которого увеличена в 4 раза по сравнению с указанной в инструкции для сыворотки или плазмы крови.

Количественными показателями концентрации противотрепонемных антител (степени позитивности) в ликворе являются титр противотрепонемных антител или коэффициент позитивности. Определение титров или коэффициентов позитивности целесообразно проводить как до лечения, так и после него для выяснения динамики выработки антител с использованием одной и той же тест - системы.

По своей диагностической эффективности при ликвородиагностике сифилиса ИФА близок к РИФ-ц, самой чувствительной и специфичной реакции при диагностике нейросифилиса. Положительной чертой ИФА является его доступность благодаря наличию производственных высококачественных тест - систем.

Источники возникновения ошибок при использовании ИФА-тест - систем делятся на вне- и внутрилабораторные. К первым относятся: нарушения техники взятия крови, условий транспортировки и хранения тест - систем и проб. Ко вторым - некачественная работа лаборантов, любые отклонения от инструкции по применению тест - системы, неисправность инструментов и приборов, неаккуратность ведения документации.

Чтобы избежать ошибок при проведении ИФА, необходимо придерживаться следующих правил:

- не использовать для исследования хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки крови, добиваясь стандартных условий взятия и хранения образцов;

- не практиковать 2-кратного и более замораживания - размораживания образцов сыворотки крови;

- не пользоваться просроченными наборами тест - систем;

- соблюдать стандартные требования к чистоте лабораторной посуды; использовать отдельные посуду и наконечники для автоматических пипеток (при их многократном использовании) для разведения конъюгатов и субстрата пероксидазной реакции (ОФД);

- проводить периодический контроль качества работы лаборантов;

- следить за строгим соблюдением инструкций по применению тест - систем;

- пользоваться автоматическими пипетками с погрешностью измерения объемов не более 5%, ежемесячно проводя метрологический контроль их работы;

- соблюдать правила эксплуатации оборудования (спектрофотометры, автоматические промыватели планшет, рН-метры);

- спектрофотометры для ИФА должны не реже одного раза в год проходить метрологический контроль, периодическому контролю подлежат также автоматические пипетки, термостаты, рН-метры;

- в ходе каждой постановки ИФА заполнять протокол исследования.

Главным достоинством ИФА является наличие отечественного выпуска тест - систем, их высокое качество, возможность автоматизации постановки и учета его результатов, что крайне важно при исследовании большого числа сывороток крови, в частности от доноров. При использовании тест - систем ИФА для лабораторий с небольшим объемом работы следует закупать тест - системы с разборными планшетами (стрипы).

ИФА диагностика сифилиса - эффективный метод. Необходимым является его более широкое использование в качестве скринингового и диагностического теста на сифилис, но обязательным при этом должно быть высокое качество выпускаемых предприятием тест - систем. Недопустима продажа и использование в медицинской практике тест - систем, не имеющих утвержденной фармакопейной статьи и разрешения Минздрава РФ на их применение в практике здравоохранения. Все утвержденные и рекомендованные в практику ИФА тест - системы прошли государственные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и в ЦНИКВИ. В процессе их промышленного выпуска должен осуществляться систематический контроль качества. К применению в медицинской практике разрешаются тест - системы, чувствительность и специфичность которых не ниже 95%.

Принцип метода заключается в том, что при соединении сыворотки крови, содержащей специфические антитела, с эритроцитами, сенсибилизированными соответствующим антигеном, наблюдается их характерная агглютинация. Постановка реакции может осуществляться в пробирках или планшетах.

Сенсибилизация эритроцитов при изготовлении тест - системы для диагностики сифилиса может производиться патогенными или культуральными бледными трепонемами.

Помимо наших производителей, ряд зарубежных фирм поставляет свою продукцию в Россию.

1. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против Treponema pallidum ("Syphilis TPHA - test"), фирма "Human", страна - производитель - Германия, распространитель - фирмы: "Биохиммак", "Лабораторная диагностика", г. Москва.

2. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против Treponema pallidum ("TPHA - nosticon"), фирма "Organon", страна - производитель - Голландия, распространитель - фирма "Organon - technics", г. Москва.

3. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против Treponema pallidum ("Syphilia TPHA 200"), фирма "Sanofi diagnostic Pasteur", страна - производитель - Франция, распространитель - фирма "Sanofi diagnostic Pasteur", г. Москва.

4. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против Treponema pallidum ("Syphilis TPHA"), фирма "Randox", страна - производитель - Великобритания, распространитель - фирма ЗАО "Protea", г. Москва.

5. Диагностикум для выявления антител к Treponema pallidum в реакции пассивной гемагглютинации ("Люис РПГА тест"), фирма "Ни-армедик Плюс", г. Москва.

В ЦНИКВИ на большом материале с отечественным диагностикумом изучена результативность РПГА по сравнению с другими тестами на сифилис при исследовании сывороток крови больных с различными формами сифилиса до лечения. В РПГА получено 99,4% положительных результатов, в РИФ-абс - 99,1%, РИФ-200 - 99,1%, РИТ - 87,7%, МР - 95,8%, в РСК с трепонемным антигеном - 95,8%, РСК с кардиолипиновым антигеном - 90,2%. В зарубежной литературе имеются указания на более позднюю выработку гемагглютининов у больных в ранний период заболевания, хотя в ЦНИКВИ выявлен высокий процент положительных результатов при сифилисе первичном, серопозитивном - 97,7%.

Общее мнение исследователей заключается в том, что РПГА является ценным диагностическим тестом при всех формах сифилиса, но особенно чувствительна она при поздних формах заболевания.

Существует микро- и макромодификации постановки РПГА, чаще используется первая из-за экономичности, быстроты постановки и учета результатов. Кроме того, есть качественный и количественный варианты постановки. Последний позволяет определять титры антител в крови. Но при этом, необходимо учесть, что при повторных исследованиях крови в РПГА необходимо использовать одну и ту же тест - систему.

Результаты РПГА учитывают через 1,5-2 ч при микрометоде или на следующий день при макрометоде. Неподвижно стоящие пластины даже при высыхании их содержимого сохраняют полученную картину:

"4+" - положительная РПГА. Эритроциты равномерно выстилают всю поверхность лунки (в виде зонтика).

"3+" - положительная РПГА. Эритроциты выстилают всю поверхность лунки, но часть их соскальзывает к центру.

"2+" - слабоположительная РПГА. Эритроциты образуют пленку на небольшом участке нижней части лунки.

"1+" - отрицательный результат РПГА. На дне лунки эритроциты образуют рыхлый осадок.

"-" - отрицательная РПГА. Эритроциты ровным плотным "колечком" или "пуговкой" лежат на самом дне лунки (без окружающего зернистого осаждения).

Испытание сыворотки крови людей в первых двух разведениях позволяет при качественной постановке реакции быстро выявлять лиц, сыворотки крови которых содержат специфические антитела к антигенам бледной трепонемы. Испытание сыворотки крови количественным методом с помощью двукратных разведений дает дополнительную информацию о концентрации специфических антител в крови.

Принцип метода заключается в соединении специфического комплекса антиген - антитело с иммунной антивидовой сывороткой, меченной флюорохромом, и выявление его с помощью люминесцентного микроскопа.

Материально - техническое обеспечение метода: люминисцентный микроскоп с ртутно - кварцевой лампой ДРШ-250, термостат, инактиватор.

Ингредиенты:

1. Испытуемая сыворотка крови. Кровь для получения сыворотки крови берут из локтевой вены в чистую и сухую пробирку в объеме 5 мл и обрабатывают так же, как для постановки реакции Вассермана. Инактивируют сыворотки крови однократно при температуре 56 град. С в течение 30 минут. В связи с тем, что РИФ-абс ставится нестерильно, использование стерильной посуды, соблюдение условий стерильности при хранении сывороток крови не обязательно. Оно имеет значение только для более длительного сохранения сывороток крови до исследования.

2. Антиген. В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-суточного орхита кролика. Здоровых кроликов - самцов с отрицательными результатами реакции Вассермана и РИТ заражают интратестикулярно и при возникновении орхита извлекают из яичек бледные трепонемы так же, как в случае получения антигена для РИТ. Полученную взвесь бледных трепонем сливают с кусочков яичка в стерильные пробирки с ватными пробками и оставляют в холодильнике при 4 град. С на сутки, после чего отделяют от осадка и при тех же условиях сохраняют весь период использования.

Получение и хранение антигена требует соблюдения условий стерильности, т. к. с одним и тем же антигеном реакция может ставиться в течение 2-4 месяцев. Для антигена следует выбирать ту взвесь, в которой не наблюдается агглютинация трепонем и имеется достаточное их количество. Антиген может быть получен в ампулах из других лабораторий. Перед каждой постановкой реакции взвесь хорошо перемешивают и исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения для определения ее густоты. Для постановки РИФ-абс необходимо иметь взвесь, содержащую 40-60 трепонем в темном поле зрения, при наличии более густой взвеси ее необходимо развести.

3. Сорбент. В качестве сорбента для РИФ-абс может быть использован ультраозвученный трепонемный антиген для РСК. Он представляет собой разрушенную ультразвуком взвесь смеси культуральных бледных трепонем штаммов V, VII, VIII, IX и Рейтера.

Каждая серия сорбента перед использованием в РИФ- абс с диагностической целью должна быть оттитрована.

Титрование сорбентов. Сорбенты титруют на 10 сыворотках крови больных сифилисом, дающих в РИФ-5 с буфером резко (4+) и слабо (2+) положительный результат, а также на 20 сыворотках крови лиц, свободных от сифилитической инфекции, дающих в РИФ-5 отрицательный результат, а также неспецифическую позитивность (2+ и более). При этом для РИФ-5 с буфером люминесцирующая сыворотка должна быть оттитрована также, как для РИФ-абс с ее разведением от 1:100 до 1:140.

Пример определения титра сорбента. Цельный сорбент, разводят фосфатным буфером, РН=7,2 в 2, 3, 4 раза и более. Берут 3 сыворотки крови от больных сифилисом, одна из которых дает в РИФ-5 резкоположительный (4+) результат, две - слабоположительный (2+), и 5 сывороток крови от людей, свободных от сифилитической инфекции, 3 из которых дают неспецифические результаты в РИФ-5 (2+ и более). Все сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным в свою очередь в 2, 3, 4 и более раз фосфатным буфером. Затем сыворотки крови исследуют в реакции. После учета результатов выбирают разведение сорбента, при котором сорбированные сыворотки крови больных сифилисом сохраняют степень позитивности, аналогичную полученной с сыворотками крови, разведенными фосфатным буфером, а сыворотки крови лиц, свободных от сифилитической инфекции, не дают свечения. Это разведение сорбента является его титром.

Титром сорбента в данном случае явилось разведение 1:3, при котором все сыворотки крови больных сифилисом сохраняли степень позитивности, полученную в контроле, и в то же время надежно снималась неспецифическая позитивность несифилитических сывороток крови.

Окончательный титр устанавливают в результате исследования 30 сывороток крови больных сифилисом и контрольных лиц.

Таблица N 13

РЕЗУЛЬТАТЫ ТИТРОВАНИЯ СОРБЕНТА

4. Антивидовая люминесцирующая сыворотка. Для исследования в РИФ - абс сывороток крови людей необходима меченная флюорохромом сыворотка крови животных, иммунизированных сывороточным белком человека. Лиофильно высушенную люминесцирующую сыворотку растворяют при соблюдении условий стерильности в дистиллированной воде в том объеме, который указан на этикетке ампул, переливают в стерильную пробирку с резиновой пробкой и в процессе использования хранят при 4 град. С в течение 1-2 месяцев.

В день постановки реакции нужное количество этой сыворотки разводят по титру дистиллированной водой. Указанное на этикетке рабочее разведение сыворотки не годится для постановки реакции с целью серодиагностики сифилиса, поэтому титр каждой серии необходимо определять заново.

Титрование антивидовой люминесцирующей сыворотки. Берут 5 сывороток крови больных сифилисом и 5 сывороток крови здоровых людей, разводят их в 5 раз сорбентом (с учетом его титра) и ставят реакцию с использованием во II фазе различных разведений люминесцирующей сыворотки против сывороточных глобулинов человека той серии, титр которой определяется. Следует учесть, что титр люминесцирующих сывороток, выпускаемых в настоящее время ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, колеблется при постановке РИФ - абс от 1:100 до 1:140. При учете реакции предварительным титром люминесцирующей сыворотки следует считать то разведение, при использовании которого с положительными сыворотками крови получено хорошее свечение трепонем, а с отрицательными свечение антигена не получено. Большее разведение люминесцирующей сыворотки, чем титр, приводит к понижению чувствительности реакции, а меньшее - к снижению специфичности. После определения предварительного титра следует его уточнить на большем числе положительных и отрицательных сывороток крови. Окончательным титром можно считать тот, который проверен на 100 сыворотках крови, причем из них не менее 20 должно быть от больных сифилисом.

Для предотвращения пророста после разведения сухой люминесцирующей сыворотки дистиллированной водой к ней необходимо добавить мертиолат из расчета 1 объема его раствора 1:1000 к 9 объемам люминесцирующей сыворотки. При взятии новых ампул той же серии титр следует только проверить и уточнить на 10 заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови.

Пример определения предварительного титра люминесцирующей антивидовой сыворотки. Готовят 60 препаратов, нумеруют их от 1 до 60. Берут 10 сывороток крови - 5 от больных сифилисом, 5 от здоровых людей. Все сыворотки крови разводят в 5 раз разведенным по титру сорбентом.

На пронумерованные 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60 препараты наносят в I фазе реакции одни и те же 10 сывороток крови, разведенных в 5 раз сорбентом. Во II фазе реакции на 1-10 препараты наносят люминесцирующую сыворотку, разведенную 1:100, на 11-20 - 1:110, на 21-30 - 1:120, на 31-40- 1:130, на 41-50 - 1:140, на 51-60 - 1:150.

Оптимальным следует считать разведение, при котором свечение антигена будет хорошим при постановке реакции с положительными сыворотками крови и не будет наблюдаться с отрицательными.

Из антигена готовят препараты на тонких, хорошо обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых стеклорезом обозначены кружки диаметром 0,7 см (по 10 кружков на 1 предметном стекле). В пределах кружка, на стекло наносят антиген - взвесь бледных трепонем. Запаянным концом пастеровской пипетки круговыми движениями взвесь распределяют в пределах кружка, высушивают на воздухе и фиксируют 10 минут в химически чистом ацетоне. Затем препараты нумеруют. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным по титру буферным раствором. В штатив помешают ряд пробирок, число и номер которых соответствует числу и номеру испытуемых сывороток крови. В пробирки пипеткой разливают разведенный по титру сорбент по 0,2 мл, затем добавляют по 0,05 мл цельной испытуемой сыворотки крови и хорошо перемешивают. Разведение сыворотки крови можно осуществлять аппаратом Флоринского. Разведенные сорбентом сыворотки крови наносят на антиген так, чтобы равномерно покрыть мазок, и препараты помещают во влажную камеру, которую закрывают крышкой и помещают на 30 минут в термостат при 37 град. С (I фаза реакции). После первой фазы препараты осторожно промывают в 2 порциях фосфатного буфера, причем во вторую порцию препараты помещают на 10 минут, высушивают, после чего их вновь помещают во влажную камеру, наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку и оставляют при комнатной температуре на 30 минут (II фаза реакции). По окончании второй фазы препараты промывают фосфатным буфером, как описано выше, высушивают и наносят на поверхность мазков по капле нелюминесцирующего иммерсионного масла (диметилфталата).

Исследование препаратов производят в люминесцентном микроскопе с ртутно - кварцевой лампой ДРШ-250 с иммерсионной системой, окуляром 4х или 5х, фильтрами СЗС-7 или 14, ФС-1, БС-8 и ЖС-18 или Т-2Н. Учет реакции осуществляется путем оценки свечения бледных трепонем. Положительными в РИФ-абс считают сыворотки крови, которые дают свечение на 4+, 3+ и 2+. Блестящее зелено - желтое свечение оценивается на 4+, яркое - 3+, слабое свечение - 2+. Отрицательными считают сыворотки крови, которые дают свечение на 1+ (трепонемы в препарате окрашены интенсивнее фона) или не дают его.

В каждой постановке РИФ-абс необходимо использовать следующие контроля:

Резкоположительный контроль. Сыворотка крови больного сифилисом, дающая свечение на 4+ при разведении буфером в 5 раз. При разведении в 5 раз сорбентом сыворотка крови не должна терять степень позитивности более чем на 1+.

Слабоположительный контроль. Цельная или разведенная сыворотка крови больного сифилисом, дающая слабую степень свечения антигена на 2+ при разведении буфером в 5 раз. При разведении сорбентом позитивность ее должна сохраняться.

Неспецифический контроль. Несифилитическая сыворотка крови, дающая при разведении буфером флюоресценцию не менее 2+. При разведении сорбентом позитивность ее должна быть ликвидирована.

Контроли антигена, сорбента, люминесцирующей сыворотки могут ставиться только при использовании новых серий этих ингредиентов.

Постановка РИФ-абс возможна не только с сывороткой крови, но и с кровью, взятой из пальца. Эту модификацию РИФ-абс можно использовать при обследовании на сифилис детей, при трудности получения крови из вены у взрослых, при массовом обследовании различных контингентов на сифилис.

При постановке РИФ-абс с кровью применяют те же ингредиенты реакции, что и при постановке РИФ-абс с сывороткой крови (антиген, сорбент, люминесцирующая сыворотка). Титр люминесцирующей сыворотки определяют по вышеизложенной схеме, но при постановке реакции с кровью. Кровь для исследования после прокола пальца пациента набирают микропипеткой до метки 0,1 мл, быстро выдувают в пробирку, содержащую 0,3 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают пипеткой и фильтруют через бумажный фильтр, смоченный дистиллированной водой. Постановка реакции с разведенной кровью возможна как в день взятия ее, так и через 1-2 дня при условии хранения при 4 град. С

Непосредственно перед постановкой реакции ко всем образцам крови, включенным в постановку реакции, добавляют по 0,1 мл цельного сорбента, перемешивают пипеткой и встряхиванием, помещают на 30 минут в термостат при 37 град. С. Затем кровь, обработанную сорбентом, наносят на мазки антигена и помещают ее во влажную камеру при 37 град. С (I фаза реакции). По истечении срока экспозиции препараты промывают в первой порции фосфатного буфера так, чтобы на стеклах не осталось следов крови, и помешают их на 10 минут во вторую порцию буфера. После высушивания мазков проводят II фазу реакции. При этом на препараты наносят разведенную по титру, установленному для данной модификации РИФ, люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека. Стекла во влажной камере вновь помещают в термостат при 37 град. С.

Через 30 минут препараты вновь промывают в 2 порциях фосфатного буфера в течение 10 минут, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии. Исследование препаратов и учет результатов реакции проводят так же, как при постановке РИФ-абс с сывороткой крови.

Методика постановки РИФ-абс и РИФ-200 близки. При постановке РИФ-200 обработка испытуемых сывороток крови, приготовление антигена, подготовка антивидовой люминесцирующей сыворотки и ее титрование производят так же, как при постановке РИФ-абс. Следует учесть только, что титры люминесцирующей сыворотки, выпускаемой в настоящее время, в РИФ-200 колеблются от 1:20 до 1:50.

Техника постановки РИФ-200. Испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз фосфатным буфером. Для этого в штатив помещают 3 ряда пробирок, число и нумерация которых в каждом ряду соответствует числу и нумерации испытуемых сывороток крови в рабочем журнале. В первом ряду налиты цельные испытуемые сыворотки крови, во втором ряду в пробирки наливают по 0,45 мл буфера, в третьем - по 0,95 мл буфера. Во втором ряду готовят разведение сывороток крови в 10 раз, для чего из каждой пробирки первого ряда отдельной 1 мл градуированной пипеткой берут 0,05 мл испытуемой сыворотки крови, переносят в соответствующую пробирку второго ряда и смешивают с имеющимся там буфером. Из каждой пробирки второго ряда той же самой пипеткой переносят по 0,05 мл разведенной уже в 10 раз испытуемой сыворотки крови в соответствующую пробирку третьего ряда и получают разведение в 200 раз.

При постановке реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят разведенные в 200 раз испытуемые сыворотки крови так, чтобы их номера, обозначенные на пробирках, соответствовали номерам на предметных стеклах. После нанесения на препараты сыворотки крови влажную камеру помещают на 30 минут в термостат с температурой 37 град. (I фаза реакции). Затем препараты промывают 10 минут в 2 порциях буфера и высушивают. После этого их вновь помещают во влажную камеру и на все наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку (II фаза реакции). Вторую фазу проводят 30 минут при комнатной температуре, после чего препараты 10 минут промывают, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии.

Учет результатов РИФ-200 производят так же, как РИФ-абс.

В том случае, когда клиницистов интересует титр флюоресцирующих антител в сыворотке крови больного, РИФ-абс и РИФ-200 следует ставить с последовательным разведением испытуемых сывороток крови и титром флюоресцирующих антител считать то наибольшее разведение сыворотки крови, которое еще дает положительный результат реакции. Обозначать титр принято числом, характеризующим степень разведения испытуемой сыворотки крови, например, 5,10,20,40 и т. д. (РИФ-абс) или 200,400, 800 и т. д. (РИФ-200).

При постановке обеих модификаций реакции для разведения испытуемых сывороток крови и для промывания препаратов после I и II фаз следует использовать фосфатный буфер следующего состава: 1 л дистиллированной воды 6,8 г натрия хлорида, 1,48 г двузамещенного фосфорнокислого натрия, 0,43 г однозамещенного фосфорнокислого калия (рН=7,2). Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более недели.

В связи с возможностью получения отрицательных результатов при наличии флюоресцирующих антител не следует исследовать кровь и сыворотку крови в РИФ-абс и РИФ-200 во время лечения больных пенициллином.

Ранняя диагностика поражений нервной системы при сифилисе является актуальным вопросом в деле борьбы с этим заболеванием. В связи с тем, что РИФ-ц обладает большей чувствительностью, чем все другие используемые для ликвородиагностики сифилиса тесты, эта модификация РИФ может быть рекомендована для диагностики сифилитических поражений центральной нервной системы при всех формах сифилиса.

Для постановки РИФ-ц используют тот же антиген, люминесцирующую сыворотку, что и для постановки РИФ-абс и РИФ-200 с сывороткой крови. Аналогичны также определение флюоресцирующих антител в ликворе и сыворотке крови и учет реакции.

Спинномозговая жидкость вводится в реакцию неинактивированной и цельной. До постановки реакции ее можно сохранять в морозильном отделении холодильника в пробирках под резиновыми пробками до 2 недель. Оттаиванние производят при комнатной температуре.

Техника постановки РИФ-ц. В I фазе реакции на антиген наносят 0,05 мл неразведенной испытуемой спинномозговой жидкости, препараты помещают во влажную камеру на 30 минут при комнатой температуре. Затем их промывают - фосфатным буфером, рН = 7.2, в течение 10 минут, высушивают. Во II фазе на препараты наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку, которую титруют при постановке реакции со спинномозговой жидкостью. Выдерживают препараты при комнатной температуре 30 минут во влажной камере, промывают, высушивают, монтируют для люминесцентной микроскопии.

Источники ошибок:

- несоблюдение условий приготовления, хранения реагентов и постановки реакции;

- низкое качество люминесцирующей сыворотки и неточное определение ее титра;

- нанесение исследуемого материала или люминесцирующей сыворотки при постановке реакции не на препарат, а на другую сторону предметного стекла;

- неправильная установка освещения в люминесцентном микроскопе;

- низкое качество антигена.

В день постановки опыта проводят подготовительную работу (сливание испытуемых сывороток крови со сгустка, их инактивация, отмывание эритроцитов барана от плазмы крови, приготовление изотонического раствора натрия хлорида). Разводят ингредиенты: гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, антигены по титру. Определяют рабочую дозу комплемента титрованием без антигенов, в присутствии антигенов.

Исследование каждой испытуемой сыворотки крови проводят в трех пробирках с двумя антигенами (таблица N 5). Одновременно исследуют для контроля заведомо положительные (4+, 2+) и отрицательную сыворотки крови. Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1:5 изотоническим раствором натрия хлорида, разливают по 0,25 мл в три пробирки, из которых третья является контрольной. В первую пробирку добавляют по 0,25 мл трепонемного антигена, во вторую - 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенных по титру. В третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Комплемент разведенный по рабочей дозе, добавляют по 0,25 мл во все опытные и контрольный пробирки. Предварительное смешивание антигена и комплемента не рекомендуется. После первичной 45 - минутной инкубации в термостате при 37 град. С добавляют во все пробирки по 0,5 мл гемолитической системы. Легким встряхиванием перемешивают содержимое пробирок и помещают их в термостат при 37 град. С на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке. Регистрируют результат реакции по наличию или отсутствию гемолиза в опытных пробирках.

Оценка результатов

Для обозначения степени позитивности реакции Вассермана пользуются системой четырех плюсов:

Полная задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - 2+ (слабоположительная реакция); незначительная задержка гемолиза - 1+; сомнительная реакция -+/-. Отрицательный результат реакции характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта.

Таблица N 5

КАЧЕСТВЕННАЯ МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

Оценку результатов регистрируют в книге протоколов лаборатории.

Результаты реакции следует давать по каждому антигену отдельно.

В случае расхождения результатов между антигенами необходимо повторить исследование новой порции сыворотки крови. Особое внимание следует обращать на образцы сыворотки крови, дающие положительный результат в РСК с трепонемным антигеном и отрицательный результат с кардиолипиновым и в МР. Поскольку трепонемный антиген является специфическим следует исследовать данную сыворотку крови в специфических тестах, в частности в РПГА из-за простоты ее постановки и быстрого получения результата.

После лечения больных по поводу сифилиса РСК с трепонемным антигеном, как и другие специфические тесты, может длительное время оставаться позитивной.

Повторное исследование необходимо также при наличии задержки гемолиза в контроле сыворотки крови (третья пробирка, не содержащая антигена).

Правильность течения опыта оценивают на основании следующих результатов:

- контроля испытуемой сыворотки крови - третий ряд пробирок (отрицательный);

- контроля с заведомо отрицательной сывороткой крови (отрицательный);

- контроля с заведомо положительной (3+ или 4+) и слабоположительной (2+) сыворотками крови.

В качестве контрольных используют лиофилизированные сыворотки крови.

Сыворотки крови положительные и слабоположительные получают из крови кроликов, зараженных патогенными бледными трепонемами (штамм Никольса), отрицательные - из крови здоровых кроликов.

Сухие сыворотки крови выпускают в ампулах по 1 мл. В день постановки реакции сыворотку крови растворяют добавлением изотонического раствора натрия хлорида для восстановления первоначального (до высушивания) объема.

После полного растворения сыворотки крови инактивируют при 56град. С в течение 30 минут. Положительные и слабоположительные сыворотки крови должны давать задержку гемолиза на 4+ и 2+ соответственно при разведении 1:5 по качественной методике постановки реакции Вассермана с кардиолипиновым и трепонемным антигенами.

Если рабочая доза комплемента выбрана неправильно (избыток комплемента), то со слабоположительной сывороткой крови будет получен отрицательный результат реакции; при недостатке комплемента наблюдается задержка гемолиза с контрольной отрицательной сывороткой крови и в контроле испытуемых сывороток крови (3-й ряд пробирок).

Источники ошибок:

- нарушение условий и методики постановки реакции;

- несоблюдение условий и срока хранения испытуемой сыворотки крови, антигенов, комплемента, эритроцитов барана;

- изменение процентного содержания натрия хлорида;

- неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте);

- исключение из постановки реакции контрольных положительных и слабоположительных сывороток крови;

- использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.

В спинномозговой жидкости больного сифилисом могут находиться противотрепонемные антитела и реагины, способные вступать в реакцию связывания комплемента с соответствующими антигенами.

Реакцию ставят с непрогретой спинномозговой жидкостью, ввиду отсутствия в ней комплемента.

Мутную или с примесью крови жидкость центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость.

Спинномозговую жидкость параллельно исследуют в трех дозах:

1) неразведенную; 2) разведенную изотоническим раствором натрия хлорида 1:2; 3) разведенную изотоническим раствором натрия хлорида 1:5 (таблица N 7).

Реакцию производят с двумя антигенами параллельно - трепонемным и кардиолипиновым - с каждым разведением спинномозговой жидкости по схеме (таблица N 7).

Ввиду отсутствия антикомплементарных свойств спинномозговой жидкости для ее исследования комплемент в реакцию вводят по титру (первая растворяющая доза без обычной надбавки). Для повышения качества ликвородиагностики сифилиса реакцию связывания комплемента рекомендуется заменять РИФ-ц или новой модификацией РИТ, методика постановки которой изложена ниже.

Оценка результатов.

Результаты реакции учитывают отдельно для каждой антигена и разведения спинномозговой жидкости. Для обозначения позитивности реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью пользуются системой четырех плюсов, описанной выше.

Таблица N 7

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА СО СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТЬЮ

Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45 минут

Источники ошибок.

Нарушение условий и методики постановки реакции. Несоблюдение условий и срока хранения спинномозговой жидкости, антигенов, комплемента, эритроцитов барана. Изменение процентного содержания натрия хлорида. Неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте).

Использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.

Постановку реакции проводят в боксе. Каждую сыворотку исследуют в двух пробирках: опытной и контрольной.

Таблица N 10

СХЕМА РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ (МИКРОАНАЭРОСТАТНАЯ МЕТОДИКА)

В обе пробирки вносят по 0,05 мл исследуемой сыворотки крови и по 0,35 мл антигена. В опытную пробирку наливают 0,15 мл активного комплемента, а в контрольную такое же количество инактивированной сыворотки крови морской свинки. После заполнения содержимое пробирок перемешивают легким встряхиванием и помещают в микроанаэростат. Из микроанаэростата с помощью вакуумного насоса удаляют атмосферный воздух и заполняют его газовой смесью из баллона, в котором содержится азот (95 частей) и углекислый газ (5 частей). При заполнении микроанаэростата газовой смесью следят за тем, чтобы стрелка манометра не доходила до нулевого уровня. В этом случае удается избежать повышения давления внутри анаэростата выше атмосферного в связи с перемещением его из комнаты в термостат с температурой 35 град., а также позволяет следить за герметичностью этого прибора. Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат на 18-20 часов.

При постановке реакции применяют 5 контрольных исследований: с заведомо положительной и отрицательной сыворотками крови, взятыми из предыдущего опыта, с активным и инактивированным комплементом и средой выживания для бледных трепонем. Контрольную отрицательную сыворотку крови применяют для суждения о степени подвижности бледных трепонем в данном опыте. Контрольную положительную сыворотку крови - для оценки степени иммобилизирующей активности в условиях данного опыта. Сыворотки крови исследуют по вышеописанной методике. Исследование активного и инактивированного комплемента и среды проводят для определения их влияния на подвижность бледных трепонем (таблица N 10).

Разлив ингредиентов при постановке реакции производят в боксе, предварительно облученном бактерицидной кварцевой лампой в течение 45-60 минут.

Оценку полученных результатов проводят через 18-20 часов. Пробирки вынимают из термостата и микроанаэростата и расставляют в штативе попарно (опытная и контрольная). Из каждой пары пробирок пастеровской пипеткой наносят капли пронумерованные соответственно опытным пробиркам на предметные стекла, накрывают покровными стеклами 20х20 мм и исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения с объективом 40, окуляром 10 х . Просматривают несколько полей зрения в разных участках препарата, подсчитывая в каждом число подвижных и неподвижных бледных трепонем. Подсчет начинают с препарата из контрольной, а затем из опытной пробирки.

В препарате подсчитывают не менее 25 трепонем и отмечают, сколько из них подвижных и сколько неподвижных.

Если в опытном препарате содержится 13-19 подвижных бледных трепонем, то для получения более достоверного результата необходимо сосчитать не 25, а 50 микроорганизмов, также отмечая среди них число подвижных и неподвижных. При подсчете 50 бледных трепонем полученное число подвижных микроорганизмов делят на 2.

Если в контрольном препарате содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 подсчитанных, то такой опыт не пригоден и исследование данной сыворотки крови следует повторить. В контрольных пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижных трепонем объясняется токсичностью исследуемой сыворотки крови, чаще всего вследствие примеси медикаментов, иногда бактериальным загрязнением.

При определении подвижности бледных трепонем следует обращать внимание на интенсивность движений, совершаемых бледной трепонемой. У бледной трепонемы не всегда можно наблюдать сгибательные и контрактильные движения и иногда только вращательные. Следует также уметь отличать активные движения трепонем от движения с током жидкости.

Расчет процента специфической иммобилизации бледных трепонем производят по следующей формуле:

А - число подвижных бледных трепонем в контрольной пробирке;

В - число подвижных бледных трепонем в опытной пробирке;

Х - процент иммобилизации.

Пример:

В практической работе процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице (N 11) с применением вышеуказанной формулы. Реакция иммобилизации считается отрицательной, когда процент иммобилизации колеблется в пределах 0-20, сомнительной от 21 до 30, слабоположительной от 31 до 50 и положительной выше 50. Сыворотки крови с сомнительными и слабоположительными результатами реакции нуждаются в повторном исследовании для получения более достоверных результатов. Целесообразно также подвергать повторному исследованию все сыворотки крови, давшие полное расхождение результатов с результатами стандартных серологических реакций. Эти сыворотки крови заслуживают особого внимания, так как в этих случаях результаты реакции иммобилизации бледных трепонем дают возможность судить о наличии или отсутствии сифилиса у обследуемого лица.

Определение остаточного комплемента. Определение остаточного комплемента необходимо для суждения о том, достаточным ли было количество комплемента в опытных пробирках, не была ли подвижность бледных трепонем обусловлена отсутствием комплемента, вследствие чего иммобилизины не могли проявить свою активность.

После регистрации результатов реакции иммобилизации бледных трепонем в содержимом пробирок определяют остаточный комплемент добавлением в каждую пробирку гемолитической системы в объеме 0,1 мл. Пробирки помещают в термостат при 37 град. С на 45 минут. В опытных пробирках должен наступить гемолиз эритроцитов, в контрольных должна быть задержка гемолиза. Отсутствие в опытных пробирках гемолиза указывает на недостаточное количество комплемента, в этих случаях исследование надо повторить . Повторное исследование сыворотки крови не производят только в том случае, если отмечена 100% иммобилизация бледных трепонем.

Источники ошибок:

- токсичность исследуемой сыворотки крови;

- бактериальное загрязнение исследуемой сыворотки крови комплемента, среды;

- недостаточное количество комплемента в опыте;

- нарушение герметичности микроанаэростата, проникновение в него кислорода из атмосферного воздуха;

- повышение или понижение температуры в термостате в течение реакции;

- кислотность или щелочность лабораторной посуды, использованной при постановке реакции.

Таблица N 11

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТА ИММОБИЛИЗАЦИИ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ

Примечание:

Ответ находят в точке пересечения горизонтальной строки с вертикальным столбцом, например: 22 подвижных трепонемы в контрольной пробирке и 8 подвижных трепонем в опытной пробирке соответствует 64% иммобилизации бледных трепонем.

Анаэробные условия при постановке реакции создаются помещением реагирующей смеси в меланжер (лейкоцитарный смеситель), оба конца которого закрыты резиновым кольцом. Меланжерная методика реакции позволяет обходиться без вакуумного насоса, баллона со смесью азота, углекислого газа, микроанаэростата. При сравнительном изучении на большом клиническом материале получены результаты, не уступающие классической анаэростатной методике.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, которая состоит из следующих этапов:

1. Получение и обработка исследуемой сыворотки крови проводится так же, как и для микроанаэростатной методики.

2. Приготовление среды для бледных трепонем. Меланжерная методика реакции выполняется с той же средой, что и микроанаэростатная.

3. Комплемент. Готовится и хранится так же, как и при выполнении микроанаэростатной методики.

4. Антиген. Применяется тот же штамм бледной трепонемы и методика его приготовления та же, что и для микроанаэростатной методики.

5. Приготовление смеси антигена с комплементом "коктейля". Предварительно в двух стерильных флаконах или колбах соединяют комплемент с антигеном, взятых в равных объемах. Количество комплемента и антигена зависит от общего числа исследуемых сывороток крови. На одну сыворотку крови расходуется 0,15 мл комплемента и столько же антигена. Антиген разливают равными частями в два стерильных флакона и добавляют в один флакон активный комплемент, а во второй - инактивированную сыворотку крови морской свинки (таблица N 12).

6. Гемолитическую сыворотку разводят так же, как и для микроанаэростатного метода.

7. Приготовление изотонического раствора хлорида натрия. Растворяют 9,0 г натрия хлорида химически чистого в 1 литре дистиллированной воды. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют автоклавированием в течение 20 минут при 1 атмосфере по манометру.

8. Всю лабораторную посуду промывают и стерилизуют так же, как при постановке микроанаэростатного метода.

Таблица N 12

РАСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ИНГРЕДИЕНТОВ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ МЕЛАНЖЕРНЫМ МЕТОДОМ

Меланжеры промывают с помощью груши, насасывая в меланжер и удаляя из него дистиллированную воду 2 раза. Промывание проводят последовательно в 3 банках. Затем меланжеры складывают в стерилизатор и кипятят в течение 30 минут. Воду сливают, а меланжеры переносят в сушильный шкаф. После высушивания складывают в картонную коробку, заворачивают в бумагу и автоклавируют так же, как другую стеклянную посуду. После стерилизации вновь высушивают в сушильном шкафу и хранят в шкафу в боксе вместе с другой посудой не более 7 дней.

Основной опыт. Каждую сыворотку крови исследуют в двух меланжерах. В первый меланжер набирают исследуемую сыворотку крови до метки "I". С конца меланжера стерильным ватным тампоном снимают остатки сыворотки крови. После этого до метки "II" набирают смесь из первого флакона. Оба конца смесителя закрывают резиновым кольцом. Во второй меланжер набирают до метки "I" ту же самую сыворотку крови, а до отметки "II" смесь из второго флакона. После одевания кольца содержимое меланжеров перемешивают, меланжеры метят и укладывают в специальный штатив или коробку с вырезами. Штативы помещают в термостат на 18-20 часов.

При постановке меланжерного метода применяют те же контрольные исследования, которые используют при микроанаэростатном методе.

Оценка полученных результатов.

Через 18-20 часов меланжеры вынимают из термостата попарно - опытный и контрольный - и содержимое переносят в заранее подготовленные и пронумерованные соответственно номерам меланжеров пробирки. Для этого после снятия кольца с меткой меланжер опускают в соответствующую пробирку. Содержимое меланжера либо свободно вытекает на дно пробирки, либо выталкивается из него при помощи резиновой части пипетки, надетой на верхний конец меланжеров. При ее помощи перемешивают находящуюся в пробирке жидкость и, не снимая пипетки с верхнего конца меланжера, нижним его концом наносят каплю жидкости из опытного меланжера на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону - каплю жидкости из контрольного меланжера. Стекла предварительно нумеруют соответственно номерам опытных меланжеров. Капли накрывают покровными стеклами, размером 20х20 мм. Регистрацию результатов и определение остаточного комплемента проводят так же, как при микроанаэростатном методе.

Источники ошибок те же, что и при применении микроанаэростатной методики реакции иммобилизации бледных трепонем.

Клиническая оценка огромного числа исследований крови в РИТ наряду с высокой специфичностью показала ее более низкую чувствительность по сравнению с другими тестами при ранних и поздних формах сифилиса, что обусловлено меньшей активностью выработки иммобилизинов в указанные периоды заболевания, хотя данные антитела в крови и ликворе остаются в наличии.

В связи с этим была предложена постановка РИТ с общепринятым и увеличенным в 2 и 4 раза объемом сыворотки крови, то есть вместо 0,05 мл испытуемой сыворотки крови в реакцию вводится 0,05; 0,1 и 0,2 мл сыворотки. Помимо этого методика постановки РИТ остается аналогичной классической. Доказано, что при использовании такой модификации с диагностической целью следует ориентироваться на процент иммобилизации бледных трепонем с 0,2 мл сыворотки крови. При этом чувствительность РИТ значительно повышается при сохранении высокой специфичности теста.

При исследовании крови в общепринятой РИТ, в реакцию вводят 0,05 мл исследуемой сыворотки крови, 0,15 мл комплемента и 0,35 мл антигена. Для приготовления антигена взвесь бледных трепонем разводят в среде выживания так, чтобы в поле зрения было 10-15 микроорганизмов. Однако такая техника постановки реакции при исследовании ликвора не обеспечивает высокой чувствительности теста.

По новой методике при исследовании ликвора в РИТ его объем увеличивают в 4 раза, т.е. в реакцию вводят 0,2 мл. Объемы комплемента (0,15 мл) и антигена (0,35 мл) не меняются, лишь при изготовлении антигена взвесь бледных трепонем разводят в среде выживания до 20-25 микроорганизмов в поле зрения.

После пункции ликвор помещают в сухую, химически чистую и стерильную пробирку. Мутный или с примесью крови ликвор центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость. В реакцию ликвор вводят цельным и неинактивированным. Перед исследованием ликвор можно сохранять в морозильном отделении холодильника при температуре от -12 град. С до -18 град. С в пробирках под резиновыми пробками до 1 месяца. Размораживание производят при комнатной температуре. Повторное замораживание и размораживание не допускается.

В остальном методика постановки РИТ с увеличенным объемом ликвора и учет результатов аналогичны общепринятой РИТ. Диагностическая эффективность вышеописанной методики близка к РИФ-ц.

При аварии во время работы с инфекционным материалом (бой посуды, разбрызгивание из шприца при заражении животных, а также во всех случаях, ведущих к загрязнению заразным материалом окружающих предметов, одежды открытых частей тела работников) присутствующий при этом персонал обязан немедленно прекратить работу, известить о случившемся заведующего лабораторией и провести обеззараживание помещения, оборудования и предметов, которые могли быть инфицированы, а также провести самообеззараживание.

Для ликвидации последствий аварии применяют следующие методы обеззараживания:

- горизонтальную поверхность, на которую попал заразный материал, заливают дезинфицирующим раствором (5% раствором хлорамина или 5% раствором карболовой кислоты);

- вертикальные поверхности (загрязненные стены, поверхность мебели, приборов) протирают ватными или марлевыми тампонами, обильно смоченными дезинфицирующим раствором;

- загрязненную одежду снимают и замачивает в дезинфицирующем растворе;

- загрязненную обувь обмывают тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором;

- открытые участки кожи лица, рук и других частей тела в случае загрязнения их заразным материалом (взвесь бледных трепонем, сыворотка крови из инфекционного отделения) обрабатывают 70% этиловым спиртом;

- при загрязнении слизистых оболочек рот прополаскивают 5% раствором соды или 0,5% раствором соляной кислоты, глаза промывают водой и закапывают свежеприготовленный 1% раствор азотнокислого серебра или 30% альбуцида, в нос закапывают 1-2 капли 1% раствора протаргола. Проводят профилактическое лечение;

- при несчастном случае, связанном с ранением или укусом зараженным животным или другими нарушениями целостности кожных покровов, необходимо выдавить из ранки кровь, смазать рану 5% настойкой йода и провести курс профилактического лечения. При оцарапывании кожи зараженным животным на место ранения кладут на 5 минут компресс с 5% раствором лизола или делают ванночку из того же раствора.

Оперативные вмешательства на зараженных животных и заражение должны производиться в фартуке, резиновых перчатках и защитных очках. После работы фартук и перчатки обрабатывают дезинфицирующим раствором, перчатки кипятят в течение 30 минут.

Тушки убитых животных, больных сифилисом, необходимо собирать в специальное хранилище с последующим сжиганием. При невозможности сжигания, тушки заливают 5% раствором хлорамина на сутки, а затем закапывают в землю вдали от жилых помещений на достаточную глубину (0,7-1 метр), не допускающую выкапывания их другими животными (крысами, собаками, кошками и т. п.).

В процессе работы и после ее окончания применяют следующие способы дезинфекции. Посуду, соприкасающуюся с бледными трепонемами или содержащую кусочки зараженных тканей, погружают в мыльную воду комнатной температуры без применения дезинфицирующих средств, кипятят в течение 30 минут в указанном растворе, охлаждают и моют водопроводной, сначала теплой, затем холодной водой, с последующим прополаскиванием дистиллированной водой.

Просвет верхнего конца пипетки, с помощью которой насасывают инфицированный материал, должен быть плотно закрыт ватным тампоном.

Пипетки, загрязненные бледными трепонемами, помещают в 3-5% раствор карболовой кислоты на 1 час, затем промывают 5-6 раз водопроводной водой и один раз - дистиллированной. Если пипетки при этом не становятся прозрачными, их погружают в раствор хромовой смеси на сутки, после чего промывают 9 раз водопроводной водой и один раз дистиллированной.

Поступившую на исследование кровь и полученную из нее сыворотку крови после работы сливают в канализационную сеть, предварительно обработав дезинфицирующим средством.

Посуду после использования промывают под проточной водой, затем замачивают в горячем (50 град. С) моющем растворе на 30 минут, полностью погружая ее в раствор и заполняя полости. Затем посуду моют ершами или ватно - марлевыми тампонами, в среднем 25-30 секунд один предмет. Вымытую посуду прополаскивают в проточной воде, затем в дистиллированной и высушивают при температуре 180-200 град. С в течение 45 минут.

В качестве моющего раствора применяют 0,5% комплекс перекиси водорода с моющими средствами - "Новость", "Прогресс", "Сульфанол", "Лотос", "Астра" и др. (33% раствор пергидроля - 20 мл + 975 мл воды + 5 г моющего средства).

Поверхность рабочих столов в конце каждого рабочего дня, а также при загрязнении их кровью, сывороткой крови обрабатывают дезинфицирующим раствором (80 мл 96град. спирта + 20 мл дистиллированной воды + 7 мл 33% пергидроля, раствором сулемы 1:1000 и др.)

В случае загрязнения рук кровью их следует вымыть теплой водой с хозяйственным мылом, насухо вытереть обработать тампоном, смоченным антисептиком (6% раствором перекиси водорода, 0,1% раствором дезоксана или 70% раствором этилового спирта).

Все манипуляции, при которых может произойти загрязнение рук кровью и сывороткой крови, следует проводить в резиновых перчатках.

При работе с кровью, сывороткой крови нужно пользоваться резиновой грушей. Насасывание ртом не допускается.

При работе в лабораториях, осуществляющих серо- и ликвородиагностику сифилиса, должны выполняться "Санитарные правила" СП 1.2. 731 - 99, 1.2. Эпидемиология. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". Минздрав России, Москва, 1999 г.

Эффективность использования метода:

В ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ на большом материале изучена результативность приведенных в инструкции методов. При серодиагностике сифилиса МР - 95,8%, РСК с трепонемным антигеном - 95,8%, с кардиолипиновым антигеном - 90,2%, РИТ - 87,7%, РИФ - 99,1%, ИФА - 99,1%, РПГА - 99,4%, положительных результатов у больных сифилисом.

Наиболее экономичной и простой является МР с кардиолипиновым антигеном, которую широко используют как отборочный тест на сифилис. Подобной чувствительностью обладает и КСР, но он более специфичен в связи с использованием трепонемного антигена.

Ввиду того, что в организме больного сифилисом выработка иммобилизинов наступает позже других специфических антител и их концентрация в крови уменьшается при поздних формах сифилиса, РИТ более эффективно при вторичном и скрытом сифилисе. Закономерно, при поздних формах сифилиса выявляются гемагглютинины (РПТА), флюорисцирующие антитела (РИФ, ИФА), как правило вырабатываются в организме больных сифилисом при всех формах сифилиса. При диагностике сифилиса нервной системы наиболее эффективна РИФ-ц с ликвором (100% чувствительность и специфичность).

Приложение N 2

УТВЕРЖДЕНО
Приказом Минздрава России
от 26.03.2001 г. N 87