Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава РФ от 26.03.2001 N 87 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА"

Лаборатории, в которых осуществляется постановка ИФА, должны быть укомплектованы:

- набором автоматических пипеток (микродозаторов), который включает в себя одноканальные пипетки переменного объема, рассчитанные на дозирование 5-40, 40-200 и 200-1000 мкл жидкости, а также 8-канальные пипетки переменного объема на 5-50 (при использовании тест - систем с рабочим разведением образцов 1:100 и 1:200) и 50-300 мкл;

- набором мерной химической посуды;

- термостатом, рассчитанным на поддержание температуры 37 град. С;

- дистиллятором лабораторным для получения дистиллированной воды;

- спектрофотометром планшетным;

- холодильником;

- рН-метром.

Результаты ИФА с сывороткой крови и ликвором при использовании всех тест - систем с автоматическим учетом регистрируют на спектрофотометре для планшетов немедленно после постановки реакции с измерением оптической плотности (ОП) раствора субстрата при длине волны 492 нм.

Выведение спектрофотометра на нулевой уровень ("бланк") осуществляют по воздуху. Учет результатов реакции проводят согласно методике и цифровым данным, изложенным в инструкции по применению, имеющейся в каждом используемом наборе. При автоматическом учете результатов реакции по величине цифровых показателей ОП в лунках с испытуемыми образцами судят о концентрации специфических антител в исследуемой сыворотке крови и ликворе. В связи с этим данный метод оценки результатов называют количественным. При каждой постановке ИФА рассчитывают критическое значение ОП (ОПкрит.) и "серую зону". "Серой зоной" является интервал от ОПкрит. - 10% до ОПкрит. + 10%. Исследуемый образец учитывают как положительный, если ОП данного образца выше "серой зоны", как сомнительный, если ОП находится в пределах "серой зоны", и как отрицательный, если ОП ниже "серой зоны". Так учитывают результаты во всех тест - системах, кроме тест - системы "ЛюисСкрин". В тест - системе "ЛюисСкрин" исследуемая сыворотка расценивается как положительная, если ее ОП превышает ОП отрицательного контроля не менее, чем в 2 раза.

К сожалению, при учете результатов реакции все ИФА тест - системы невозможно привести к единому стандарту. Один и тот же образец может давать в разных тест - системах совершенно разный уровень окрашивания раствора субстрата. Это зависит от конструкции самой тест - системы, используемого антигена, концентрации конъюгата и др., а также от величины ОПкрит. Поэтому более точной оценкой результатов ИФА является титр противотрепонемных антител каждого положительного образца. С целью определения титра производят последовательные 2-кратные разведения испытуемой сыворотки крови, давшей положительный результат. За титр принимают наибольшее разведение сыворотки, дающее положительный результат. Следовательно, титр является количественным показателем уровня специфических антител в данном образце и степени его позитивности. Но следует учитывать, что повторное исследование сыворотки крови должно осуществляться с той же тест - системой, так как титр антител в одном и том же образце может быть различным при использовании разных тест - систем.

При применении тест - системы с визуальным учетом результатов также рекомендуется определение титров противотрепонемных антител в резко положительных сывороточных образцах (4+).

Отрицательной чертой количественного метода исследования с целью определения титра антител в сыворотке крови и ликворе является его неэкономичность. В связи с этим целесообразно использовать другой критерий для характеристики концентрации антител - коэффициент позитивности (КП), равный отношению оптической плотности, полученной для каждого образца, к критической оптической плотности: КП = ОП/ОПкрит. КП у положительных образцов выше 1,1, сомнительных - находится в интервале от 0,9 до 1,1 и отрицательных - ниже 0,9. Определение КП целесообразно проводить при выяснении динамики выработки антител у пациента в процессе наблюдения за ним после лечения сифилиса, при этом обязательно нужно использовать ту же тест - систему, что и до лечения больного. Эта методика не требует дополнительных финансовых затрат и дает представление об эффективности лечения.

При использовании тест - системы иммуноферментной для качественного выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови человека ("АТ-Треп.-ИФТС", г. Ставрополь) возможен только визуальный учет результатов реакции. При резко положительном (4+) результате субстратная смесь имеет темно - коричневый цвет, при положительном (3+) - коричневый цвет, при слабоположительном (2+) - светло - коричневый, при отрицательном (+,-) - светло - бежевый цвет или бесцветна.

Образцы, для которых получен сомнительный результат (соответствующая им ОП находится в пределах "серой зоны" и КП в интервале от 0,9 до 1,1) подлежат повторному анализу. При повторном сомнительном результате рекомендуется анализ с новой порцией крови, взятой через 3-7 дней.