Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Росрыболовства от 04.08.2009 N 695 "ОБ УТВЕРЖДЕНИИ МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ ПО РАЗРАБОТКЕ НОРМАТИВОВ КАЧЕСТВА ВОДЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ, В ТОМ ЧИСЛЕ НОРМАТИВОВ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОДАХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ"

Рыбы (наряду с водными млекопитающими) находятся в области конечного звена трофической цепи водных экосистем и включают две трофические группы - мирных и хищных видов рыб, из которых хищники занимают высшее звено по сравнению с мирными.

Определение ПДК веществ на ранних стадиях эмбриогенеза и на взрослых рыбах важно с двух точек зрения - установления опасности вещества для существования популяции рыб в водном объекте и угрозы здоровью человека при употреблении их в пищу.

Эти особенности рыб учитываются при выборе тест-объектов, установлении параметров и критериев токсичности, кумулятивных свойств, патологических изменений и отдаленных последствий действия исследуемых веществ.

Для определения наиболее чувствительных (уязвимых) звеньев среди разных групп рыб параметры токсичности следует определять на наиболее чувствительных к веществу видах и возрастных группах, кумулятивные эффекты и поиск наиболее чувствительных физиолого-биохимических показателей - на средне- и малочувствительных.

Выделяют три группы рыб, обладающих разной чувствительностью по отношению к большому числу токсических веществ:

а) высокочувствительные - все виды лососевых, а также голец, судак, плотва, пескарь, верховка;

б) среднечувствительные - голавль (возраст 1+), гольян, лещ, окунь, красноперка;

в) малочувствительные - голавль (возраст 2+ и старше), карп, карась.

Целесообразно использовать виды рыб, широко распространенные в местных водных объектах и хорошо переносящие содержание в лабораторных условиях.

6.1.1. Вводные замечания

Контролируются эмбриональное развитие рыб в исследуемой воде, выклев свободных эмбрионов (предличинок) и выживаемость предличинок после выклева. Из литературных источников и из опыта нормирования известно, что эмбрионы рыб и предличинки более чувствительны к токсическому воздействию по сравнению со взрослыми особями.

В настоящих Методических указаниях описан порядок работы с аквариумной рыбкой данио рерио, но наряду с этим видом могут быть использованы вьюн, осетр, форель и др.

6.1.2. Характеристика тест-объекта

В качестве тест-объекта для определения ПДК вещества по эмбриональному развитию удобно использовать икромечущую аквариумную рыбу данио Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), поскольку материал для исследования можно получать в течение всего года, независимо от периодичности работы рыбоводных заводов. В природе данио обитает в медленно текущих водных объектах Юго-Восточной Азии. Длина взрослых рыб до 4,5 см. Тело цилиндрической формы, серебристое с 7 - 9 темно-синими горизонтальными полосами. Полосы идут к хвостовому и анальному плавникам. Спина окрашена в оливково-зеленый цвет.

6.1.3. Условия лабораторного содержания

Для содержания рыб-производителей могут быть использованы аквариумы объемом от 25 дм3, заполненные отстоянной водопроводной водой с температурой 22 °C. Для кормления может быть использован сухой корм, но при подготовке к нересту необходимы живые корма (дафния, циклоп, мотыль, отмытый трубочник).

Для получения икры самок и самцов отделяют друг от друга и кормят живым кормом. Плотность посадки рыб в этот период не отличается от обычного содержания. В конце второй недели самцы приобретают густой золотистый блеск, а брюшко самок значительно увеличивается в объеме за счет икры. Наиболее подготовленных к нересту рыб отлавливают и помещают в нерестовый аквариум.

Нерестовый аквариум наполняют свежей отстоянной водой с жесткостью не более 4,0 мг экв/л, с температурой около 27 °C и pH 6,8 - 6,9. В аквариум должна быть помещена сетка с ячеями 3 мм, которая служит для предохранения от поедания икры и личинок рыб взрослыми рыбами. Отложенная оплодотворенная икра опускается на дно, проходит сквозь сетку и становится недоступной для рыб. При размещении сетки следят, чтобы над сеткой осталось не менее одного литра воды для плавания производителей.

В нерестовый аквариум утром помещают самок и кормят сухим кормом, а вечером в этот же аквариум помещают по 2 - 3 самца на каждую самку, еще раз кормят всех рыб, а затем выключают свет. Стимулом к нересту служит утреннее включение света.

Обычно выклев у данио завершается через 48 ч после нереста, а еще через 48 ч предличинки начинают переходить на активное питание и становятся личинками. Переход предличинок на активное питание завершает данный этап исследований.

6.1.4. Проведение исследований

Для определения ПДК вещества на эмбрионах и личинках рыб ведут наблюдение за эмбриональным развитием данио и выклевом предличинок в контроле и исследуемых концентрациях веществ. После нереста взрослых рыб отсаживают, а оплодотворенные икринки помещают в чашки Петри. В каждую чашку с отстоянной водой (контроль) и с исследуемыми растворами помещают по 10 икринок. Концентрации исследуемого вещества готовят с шагом либо на порядок, либо в арифметической прогрессии, ориентируясь на максимальные допустимые концентрации вещества, полученные в опытах на других организмах. Исследование каждой концентрации проводится в трехкратной повторности.

Выклюнувшиеся предличинки помещаются по 10 штук в контрольную и тестируемую воду. Наблюдение ведется, как и в первом случае, в чашках Петри, которые должны находиться в термостатируемых условиях. Длительность эксперимента определяется переходом личинок на активное питание.

6.1.5. Учет и анализ результатов

Основными показателями токсичности вещества являются выживаемость эмбрионов и личинок, морфометрические параметры, тератологический анализ. В качестве дополнительных показателей эмбриотоксикологической оценки влияния исследуемых веществ могут служить биохимические исследования (например, липидный и белковый обмен у эмбрионов и предличинок рыб).

В опытах через каждые 6 ч учитывают состояние тест-объекта и ход выклева. Учитывается оплодотворение икры, а также гибель и морфологические изменения у эмбрионов в процентах по отношению к контролю.

Процент оплодотворения выявляется уже через сутки после нереста. Неоплодотворенные икринки белеют и легко отличаются от нормально развивающихся, которые остаются прозрачными.

Становятся белыми также и погибшие эмбрионы вследствие коагулирования белка. Гибель эмбрионов бывает наибольшей в начале и в конце эмбрионального периода.

Выклев - наиболее чувствительный и важный этап, завершающий эмбриональное развитие у рыб. Эмбрионы, достигшие стадии выклева, в результате действия токсичного агента часто оказываются неспособными выйти из оболочек и погибают. Важным показателем является распределение выклева на весь период эмбрионального развития. Если под влиянием токсикантов нарушается эмбриональное развитие, то максимум выклева смещается по сравнению с контролем или растягивается во времени.

Морфометрические исследования лучше всего проводить на выклюнувшихся предличинках. У эмбрионов вредные воздействия веществ могут вызывать морфологические изменения, которые служат в качестве интегрального показателя эффекта действия вещества. Появление уродств свидетельствует о тератогенном действии. Уродливые эмбрионы, погибшие во время эмбрионального развития, включаются в число погибшей икры, а средний процент уродств подсчитывается после выклева и прохождения стадий предличинки.

Личинки, которые способны нормально плавать и переходят на активное питание, считаются выжившими. Нормальными считаются особи, не имеющие морфологических отклонений и не отличающиеся размерами от контрольных.

В качестве максимальной допустимой концентрации вещества для ранних стадий онтогенеза рыб принимается максимальная концентрация, не вызывающая статистически достоверного повышения смертности эмбрионов и личинок, увеличения числа особей с дефектами развития или отставания личинок в размерах и темпах развития.

6.2.1. Характеристика тест-объекта

В экспериментах используются мальки, сеголетки, годовики отдельных видов рыб с разной чувствительностью (п. 6 Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям). При отсутствии достаточного количества промысловых рыб и условий их содержания целесообразно проводить опыты на "сорных" рыбах с высокой и средней чувствительностью к токсическим веществам, например верховках и пескарях, а также использовать аквариумных рыбок, например данио. Выбор других рыб в качестве тест-организмов должен быть обоснован литературными и экспериментальными данными.

6.2.2. Условия лабораторного содержания

Для исследований подбирают некрупных одноразмерных рыб в хорошем физиологическом состоянии из водных объектов. Рыб транспортируют на специально оборудованном транспорте с регулируемой подачей кислорода. При длительных перевозках необходим постоянный контроль за кислородным режимом и температурой воды, так как при резких перепадах гидрохимических показателей возможна значительная гибель перевозимой рыбы. При кратковременных перевозках можно использовать молочные бидоны или полиэтиленовые мешки, не допуская травмирования рыбы и резкого снижения содержания кислорода в воде.

В аквариальных условиях привезенную рыбу рассаживают в специально оборудованные проточные лотки, ванны или бассейны. Вода в данных емкостях должна быть одинаковой температуры с температурой воды в перевозимых емкостях.

При содержании рыб необходимо поддерживать оптимальный водообмен в емкостях из расчета 1 - 1,5 м3 воды в сутки на 1 кг лососевых рыб и 0,5 - 1 м3 на 1 кг карповых рыб. Если нет условий для осуществления постоянного протока воды, необходимо проводить смену ее в емкостях с рыбой, исходя из содержания кислорода в воде. Для лососевых рыб содержание растворенного кислорода в воде должно быть не ниже 9,5 - 10,5 мг/дм3, а для карповых - не менее 6 - 8 мг/дм3.

После помещения рыб в емкости в течение 10 дней (при постепенной адаптации рыб к аквариальным условиям) проводят контроль за температурой и кислородом в емкостях, проводя измерения два раза в день. Для обогащения воды кислородом рекомендуется применять принудительную аэрацию, а для повышения до необходимого уровня температуры - аквариумные водонагреватели с датчиками.

Для кормления рыб используют пастообразные, гранулированные или живые корма из расчета от 0,8 до 5% к весу тела рыб. Емкости, используемые для содержания рыб, необходимо ежедневно очищать от скапливающихся остатков корма и фекальных масс.

Помещение аквариальной должно быть оборудовано стеллажами с аквариумами или ваннами.

Из другого оборудования необходимо иметь:

холодильные установки для хранения корма и реактивов;

весы аналитические с разновесами;

весы аптекарские (чашечные и ручные);

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;

лупу;

электромешалку;

вентиляторы;

ведра эмалированные;

бидоны;

тазы и кюветы разных размеров;

фотоаппарат;

сачки разноячейные;

покрытия из мелкоячейной сети, газа или дели для емкостей с рыбой;

микрокомпрессоры;

аквариумные водонагреватели с датчиками;

скальпели, пинцеты, ножницы, шприцы на 1 - 20 мл, инъекционные иглы;

секундомер, линейки;

набор инструментов и реактивов для исследования крови;

стеклянную посуду емкостью от 0,1 до 3 л, мерные пипетки, глазные пипетки, бюретки, мерные стаканы, колбы, чашки Петри, стеклянные трубки и палочки;

резиновые шланги разного диаметра и длины, резиновые груши;

полиэтиленовую пленку, клеенку, марлю, халаты, резиновые фартуки, сапоги и перчатки;

карандаши по стеклу, лейкопластырь, фиксирующие и дезинфицирующие жидкости;

журналы для записей и прочие необходимые материалы и инструменты.

6.2.3. Проведение исследований

Перед началом экспериментов рыб помещают в аквариумы или другие экспериментальные емкости на 7 - 10 суток с целью адаптации к новым условиям. Опыты проводят на двух-трех видах рыб из различных семейств (желательно хищных и мирных) и выявляют рыб с высокой чувствительностью к токсиканту путем определения ЛК_0, ЛК_50 и ЛК_100 в острых опытах длительностью 96 ч. Хронические опыты начинают с концентрации, равной 1/2 ЛК_50 за 96 ч, и создают токсикологический ряд из 5 - 10 убывающих концентраций вещества с множителем 1/2. Длительность хронических опытов составляет 1 - 3 месяца. В зависимости от стабильности исследуемого вещества в воде.

Эксперименты проводят в стеклянных аквариумах или пластмассовых ваннах емкостью 20 - 40 дм3 в двукратной повторности с использованием 6 - 10 особей в каждой концентрации вещества. Два аквариума служат контролем.

Норма посадки молоди, сеголеток и годовиков лососевых и сиговых рыб в экспериментальные емкости для проведения опытов должна быть не более 1 г ихтиомассы на 1 дм3 воды в сутки. Для рыб возрастом более года, а также для карповых рыб эта величина составляет не более 3 г на 1 дм3 воды в сутки.

Взвешивание рыб производят перед началом опытов, затем через каждые 10 - 15 суток до их окончания. Для этого на весы ставят сосуд емкостью 2 - 2,5 дм3, в который наливают 0,5 - 1 дм3 воды и уравновешивают его с помощью гирь или другого сосуда с водой. Затем отловленных сачком рыб быстро помещают в сосуд с водой для взвешивания, предварительно осушив низ сачка от избытка влаги марлей. Мальков взвешивают с помощью химических стаканов на аптекарских или других более точных весах.

Для опытов используется незагрязненная вода из природных водных объектов или водопроводная дехлорированная вода, отстоянная в течение трех суток. Ежедневно измеряется температура воды, и один раз в 10 суток проводятся гидрохимические исследования за содержанием растворенного в воде кислорода и pH.

В зависимости от стабильности исследуемого вещества смену воды в опытных емкостях проводят один раз в 1 - 3-е суток, спустя 1,5 - 2 ч после кормления рыб. При этом недопустимо травмирование рыб. Аэрация воды возможна лишь в тех случаях, когда состав и концентрация исследуемого вещества не изменяются. Толщина слоя воды в аквариуме для сеголеток и годовиков должна быть не менее 20 см, для более крупных рыб ее следует увеличивать.

В аквариумах должна постоянно поддерживаться оптимальная для исследуемого вида температура воды.

При кормлении необходимо учитывать видовые и возрастные особенности питания рыб. Используют рыбные комбикорма, говяжью и свиную селезенку в смеси с комбикормами, а также живые корма - дафнии, хирономиды, гаммарусы и др.

Схема и динамика проведения опытов, учет регистрируемых показателей ведется в лабораторном журнале.

Опыты по определению параметров острой и хронической токсичности веществ, по установлению коэффициентов кумуляции ставят на мальках или сеголетках. После этого ставят острые и хронические опыты на сеголетках или двухлетках для определения их токсичности по физиолого-биохимическим показателям, используя среднесмертельные, максимально переносимые и более низкие концентрации для установления пороговых.

6.2.4. Учет и анализ результатов

6.2.4.1. Выживаемость рыб определяется путем систематического учета живых и погибших рыб на протяжении всего опыта (в острых опытах через 24, 48 и 96 ч, в хронических - через 5, 10 и далее через каждые 10 суток опыта). Полученные данные обобщают и выражают в абсолютных и процентных величинах. Устанавливают границы выживания рыб в зависимости от концентрации вещества и времени его воздействия на организм. Находят переносимую концентрацию вещества, которая не вызывает гибели рыб.

6.2.4.2. Прирост или снижение ихтиомассы устанавливают на основе данных периодического взвешивания рыб в хроническом опыте (каждые 10 суток). Этот показатель выражают в процентах от начальной массы или индивидуально.

6.2.4.3. Клиническую картину (симптомы отравления) оценивают по изменению поведения рыб в водной среде и реакции на внешние раздражители путем периодического осмотра их в опыте. Изменение поведения и местонахождения рыб в воде может свидетельствовать о поражении многих систем организма.

С повышением токсичности вещества чаще наблюдается тенденция к подъему рыб в поверхностные слои при наличии возбуждения или общего угнетения, дискоординации движений, расстройств дыхания и других патологических признаков. Незадолго до гибели большая часть рыб опускается на дно.

При отравлениях реакции рыб на внешние раздражители могут усиливаться, ослабевать или полностью исчезать. В качестве раздражителей при проведении токсикологических исследований можно использовать стук по стенкам аквариума, включение и выключение света, всплеск воды в аквариуме, прикосновение сачком или стеклянной палочкой к телу рыб, искусственно создаваемый ток жидкости путем слива или слабого вращения воды при помощи лопаточки и другие приспособления.

Несмотря на некоторые различия в развитии процесса отравления рыб ядами, как правило, наблюдают следующие стадии интоксикации - начало беспокойства (учащение дыхательного ритма, беспокойное дыхание, отставление плавников), первые признаки расстройства чувствительности (судорожное дыхание, поднятие лучей плавников, неполное закрытие рта), усиление раздражимости (стремительное плавание или неподвижность, сильная реакция на внешние раздражители или полное ее отсутствие), первое расстройство координации движений (кратковременное опрокидывание на бок или на спину, кружение вокруг продольной оси тела, толчкообразные движения), полная потеря равновесия (стабильное изменение положения тела, плавание на боку, вверх брюшком по кругу и штопорообразно, дрожание мышц и плавников, судороги тела), агония (опускание на дно аквариума, удушье, паралич). Все эти признаки регистрируют через 24, 48 и 96 ч в острых опытах и через 5, 10 и далее через каждые 10 суток в хронических опытах. Выявляют концентрацию вещества, при которой не проявляются внешние признаки интоксикации.

На основании сачковой пробы оценивают резервную силу организма рыб по времени трепетания на сачке. Отловленных взрослых рыб из растворов с разными концентрациями вещества помещают на плоскодонный сачок и регистрируют время прекращения трепетания, оценивают характер и силу движений. Полученные данные сравнивают с результатами, полученными на рыбах из контрольных аквариумов, а в естественных условиях - из незагрязненных водных объектов или контрольных участков. При острых, подострых и хронических токсикозах всегда отмечается резкое сокращение времени трепетания рыб. Полученные результаты сводят в таблицы, подвергают статистической обработке и по графической зависимости времени трепетания от концентрации вещества устанавливают пороговую и недействующую концентрации.

6.2.4.4. Характер питания зависит от вида рыб и от особенности поедания корма. Хищные рыбы (радужная форель, лосось и др.) активно набрасываются на корм, стараясь поймать его на лету у поверхности воды. Мирные рыбы (карп, сазан) корм берут спокойно, заглатывая его в толще воды или собирая на дне аквариума. При отравлениях эти реакции угнетаются или полностью подавляются. При явных признаках интоксикации рыбы полностью отказываются от корма. В конце экспериментов устанавливается концентрация раствора, при которой не происходит нарушения рефлекса питания.

6.2.4.5. Характер и частота дыхания. Наблюдения ведутся через 24, 48 и 96 ч в острых опытах и через 5, 10 и далее через каждые 10 суток в хронических опытах путем оценки силы, частоты и ритма дыхательных движений жаберных крышек с помощью секундомера по отношению к контролю в течение 1 - 10 минут. Нормальное дыхание у рыб характеризуется спокойными, ритмичными, умеренной силы (амплитуда) и частоты колебательными движениями жаберных крышек. Норма устанавливается в каждом конкретном случае на здоровых рыбах. При отравлениях можно наблюдать различные расстройства дыхания, в том числе резкое учащение колебательных движений жаберных крышек, беспорядочное дрожание жабр с последующей остановкой дыхания, периодическое прекращение и возобновление учащенных или замедленных дыхательных движений с увеличенной или уменьшенной амплитудой колебательных движений жаберных крышек.

6.2.4.6. Внешний вид (состояние кожных покровов, плавников, органов зрения). Хорошее состояние рыб характеризуется энергичностью, округлостью спины, упругостью мышц, полным упругим животом с наличием полостного жира во внутренних органах при нормальном состоянии печени. Истощенные рыбы характеризуются как вялые, пассивные, с опавшей и заостренной спиной, запавшими глазами, подтянутым животом, мягкой мускулатурой, истонченной брюшной стенкой и отсутствием полостного жира на внутренних органах. Состояние отдельных органов и систем организма оценивают в конце опыта и у погибших рыб в течение эксперимента общими методами исследования (вскрытие, осмотр, определение запаха, измерение, фотографирование и зарисовки). Используют также разнообразные специальные методы исследования (микроскопия, электрокардиография, рентгенография, запись дыхания и др.). При отравлениях могут быть обнаружены самые разнообразные изменения в органах и тканях рыб, которые в совокупности характеризуют особенности течения того или иного токсикологического процесса.

На коже часто обнаруживают изменения слизистого покрова, покраснения (гиперемия), кровоизлияния, новообразования (опухоли), рубцы, эрозии, язвы, ерошение и выпадение чешуи, появление налетов и выделение слизи. Аналогичные изменения возникают на плавниках, которые иногда деформируются и разрушаются вплоть до оголения лучей. Мускулатура рыб при отравлениях может стать дряблой, водянистой, тургор ослабляется, при надавливании пальцем обнаруживается медленно выправляющаяся вмятина. Нередко наблюдаются парезы, параличи, уплотнение или расслабление отдельных групп мышц головы, туловища и хвостового стебля с соответствующими искривлениями тела. Глаза больных рыб застланы пеленой, тусклые, помутневшие, с бледным рисунком. Иногда обнаруживаются пучеглазие, кровенаполнение сосудов, кровоизлияние в переднюю, заднюю камеры и ткани глаз.

6.2.4.7. Состояние жаберного аппарата. Осмотр производится при жизни и после гибели рыб под водой и в воздушной среде. Рыб отлавливают, заворачивают в марлевую салфетку, отводят пальцем жаберную крышку в сторону и осматривают жабры визуально или с помощью лупы. Осмотр жабр под водой производится путем погружения рыбы на глубину 3 - 5 см, при этом многие патологические изменения гораздо лучше заметны, чем при осмотре в воздушной среде. В норме жабры полнокровные, ярко-красного цвета, чистые, жаберные лепестки ровные, лежат параллельно, соприкасаясь друг с другом, свободный край их образует ровный полукруг относительно жаберной дужки. При отравлениях рыб жабры приобретают различные оттенки - темно-вишневый, красный, бледно-красный, бледный желтовато-розовый, темно-бурый, сероватый и др. Жаберные лепестки набухают и лежат беспорядочно.

6.2.4.8. Патологоанатомическое вскрытие рыб проводится при гибели и обязательно после окончания опыта. Перед вскрытием рыб измеряют, взвешивают, фотографируют, изготавливают препараты. После вскрытия определяют цвет, запах, консистенцию, местоположение, деформацию, кровенаполнение, дегенерацию органов и тканей, а также наличие или отсутствие жировых отложений (по балльной системе). Отбирают материал для гистологических исследований при ЛК_50, ЛК_40 и предполагаемой пороговой концентрации.

6.2.4.9. Гистологические и гистохимические свидетельства поражения органов и тканей рыб могут наблюдаться и в отсутствие клинических симптомов интоксикации. Для исследований берут только свежий материал - от живых или находящихся в состоянии агонии рыб либо от только что погибших особей. В хронических опытах фиксацию органов подопытных рыб следует производить в конце опытов. Для изучения воздействия токсических веществ гистологическому и гистохимическому исследованию подвергают жабры, печень, почки, желудочно-кишечный тракт, половые продукты, селезенку, поджелудочную и щитовидную железы, головной мозг, сердце, мышцы туловища, кожные покровы. Для сравнения обязательно фиксируют и исследуют органы и ткани контрольных рыб. После вскрытия рыбы материал немедленно фиксируется во избежание обезвоживания и деформации поверхностных слоев клеток. Толщина кусочков органов для фиксации должна быть не более 1 см, чтобы фиксирующая жидкость легко и быстро проникала в ткань. Сроки фиксации для разных фиксаторов различны, как правило, они тем короче, чем выше температура фиксатора. При использовании большинства фиксаторов наилучшие результаты дает длительная фиксация (3 - 5 минут) при температуре от 1 до 18 °C. Объем фиксирующей жидкости должен в 15 - 20 раз превышать объем фиксируемых кусочков. Мелкие органы фиксируются целиком, из крупных вырезают пластинки с таким расчетом, чтобы на гистологических препаратах были как нормальные, так и изменившиеся части органа. Во избежание разрушения внутренние органы рыхлой консистенции, особенно мелких рыб, фиксируют вместе с близлежащими тканями. Хорошими фиксаторами служат жидкость Буэна, 5 - 10%-й нейтральный формалин, смесь спирта, формалина и уксусной кислоты, жидкость Карнуа. При оценке изменений описывают общую микроскопическую картину и данные гистохимических исследований (на гликоген, жир и др.).

Морфологические изменения у рыб при воздействии токсических веществ не всегда являются строго специфическими для каждого яда, чаще всего по ним можно определить, к какой группе относится ядовитое вещество. Гистохимические реакции и электрономикроскопические исследования более чувствительны и позволяют точнее определить пороговую концентрацию.

6.2.4.10. Гематологические и биохимические показатели широко используются в ихтиопатологии, ветеринарии, медицине, в токсикогигиенических исследованиях. Они углубляют представление о динамике интоксикации организма гораздо раньше, чем появляются внешние признаки отравления рыб. Определяют следующие показатели: количество эритроцитов и лейкоцитов, эритроцитарные картины и морфология форменных элементов крови, размеры клеток крови, общий белок, активность пероксидазы (каталазы) или холинэстеразы.

Для взятия крови рыбу завертывают в марлевую салфетку. Место, откуда предполагают взятие крови, освобождают от слизи и избытка влаги ватно-марлевым тампоном. Пробы крови получают из жаберной вены путем введения тонко оттянутой пастеровской пипетки в жаберный сосуд нижней трети жаберной дужки, а также из сердца с помощью полой иглы или пастеровской пипетки. Место укола в сердце лежит в середине линии, соединяющей основание правого и левого грудных плавников. Иглу вводят в сердце под углом 45° относительно фронтальной плоскости тела рыб. Кровь можно также отобрать из хвостовой артерии после отрезания хвоста или с помощью полой иглы или пастеровской пипетки, погружая их на медиальной линии позади анального плавника под углом 45° до упора в позвоночник рыбы. Взятая кровь быстро свертывается, поэтому необходимо в возможно более короткий срок (40 - 50 секунд) взять максимальное количество проб на определение различных гематологических и биохимических показателей.

В качестве антикоагулянта применяют гепарин или лимоннокислый натрий в виде порошка или 3,8% раствора, которым ополаскивают пробирки, или добавляют 1/4 часть раствора к объему крови. Для определения общего белка антикоагулянт не добавляют, а оставляют пробирки с кровью в теплом месте для отделения плазмы и получения сыворотки.

Отбор проб крови и анализ проводят в следующей последовательности:

а) берут кровь от рыб;

б) приготавливают мазок крови;

в) заряжают меланжер для количественного подсчета форменных элементов крови или отбирают пробы крови в пробирку с раствором хлористого натрия для определения количества эритроцитов фотоколориметрическим методом на эритрогемометре;

г) заряжают гемометр Сали для определения содержания гемоглобина крови или отбирают пробы крови для определения этого показателя на эритрогемометре;

д) определяют содержание гемоглобина в крови по методу Сали или на эритрогемометре;

е) подсчитывают число эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева или на эритрогемометре;

ж) фиксируют и окрашивают взятые мазки крови;

з) подсчитывают количество лейкоцитов и определяют эритроцитарные картины; - определяют общий белок сыворотки крови методом Лоури;

и) исследуют пероксидазную активность по методу Попова и Нейковска.

Приемы и методы гематологических анализов описаны в соответствующих руководствах (Кудрявцев А.А., Кудрявцев Л.А., Привольнов Т.Н. Гематология животных и рыб. М.: Колос, 1969; Балаховский С.Д., Балаховский И.С. Методы химического анализа крови. М.: Медгиз, 1953).

Полученные результаты сводят в таблицы, подвергают статистической обработке и в соответствии с изменениями исследуемых показателей от концентраций вещества устанавливают пороговую и недействующую концентрации (ЛК_16 и ЛК_0) в хроническом эксперименте.

6.2.4.11. Органолептические свойства и вкусовые качества бульона и мяса рыб. После вскрытия и обследования по показателям, приведенным выше, рыб обмывают чистой питьевой водой, помещают в стаканы или колбы, заливают чистой питьевой водой в соотношении 5 частей воды на 1 часть рыбы и без добавления соли варят в течение 5 - 10 мин. на слабом огне. После охлаждения до комнатной температуры у сваренных контрольных и опытных рыб вырезают кусочки спинных мышц весом 0,2 - 0,5 г (в зависимости от веса рыбы). Кусочки мяса помещают в рыбный бульон, разлитый по нумерованным чашкам Петри. Порядок нумерации чашек Петри с контрольными и подопытными рыбами оглашается дегустаторам только после окончания дегустации. Для проведения дегустации приглашается 3 - 5 человек. Испытатели отмечают цвет бульона, присутствие или отсутствие постороннего запаха, а затем цвет и присутствие или отсутствие постороннего запаха мяса рыб.

После этого определяют вкусовые качества мяса рыб и наличие постороннего привкуса. В норме вкус мяса рыб сладковатый. После дегустации образец продукта выбрасывают в банку, полость рта ополаскивают питьевой водой. Результаты дегустации испытатель вносит, не оглашая, в таблицу по форме 8.

Форма 8

Запись результатов органолептических исследований

Обобщая дегустационные таблицы, испытатель делает заключение о наибольшей концентрации вещества, которая, по данным большинства дегустаторов, не вызывает изменений органолептических свойств бульона и мяса, вкусовых качеств мяса рыб.

6.2.4.12. Кумулятивные свойства (материальная и функциональная кумуляции) химических веществ на рыбах определяются по нижеописанной схеме в соответствии с Методическими указаниями по разработке предельно допустимых концентраций пестицидов в воде рыбохозяйственных водоемов (Минрыбхоз СССР введены в действие от 19 января 1979 г. N 08-3/178 "Методическими указаниями по разработке предельно допустимых концентраций пестицидов в воде рыбохозяйственных водоемов". Ростов-на-Дону, 1979).

а. Оценка накопления вещества в рыбах (материальная кумуляция вещества) проводится минимум при двух концентрациях. Опыты ставят по методике проведения хронического эксперимента длительностью не менее 30 суток (или используют для анализа рыб из проводимого хронического эксперимента). В течение этого периода через каждые 5 суток (5, 10, 20, 25, 30-е) отбирают особей для оценки содержания вещества в органах и тканях опытных и контрольных рыб, которые до окончания эксперимента можно хранить в холодильнике. Из 6 отобранных проб эффект накопления можно предварительно оценить в пробе, отобранной на 30-е сутки. Если при этом концентрация вещества в рыбе превышает концентрацию в исследуемой воде, проводится анализ всех проб, если не превышает - аналитическое исследование остальных проб можно не проводить.

Для количественной оценки материальной кумуляции используют коэффициент накопления (К_н), который представляет собой отношение максимального содержания вещества в организме рыб (мг/кг) к его концентрации в воде (мг/л).

В зависимости от величины коэффициента материального накопления (К_н) вещество по классификации К.К. Врочинского (Таблица 6.2.1) относят к соответствующей группе с коэффициентом запаса (Кз_н).

Таблица 6.2.1

Классификация веществ по степени накопления их в организмах

б. Оценка функциональной кумуляции вещества проводится для характеристики возможного перехода материальной кумуляции вещества в токсический эффект в хроническом эксперименте (накопление токсического эффекта при воздействии вещества на организм).

Для оценки функциональной кумуляции вещества, после расчета параметров острой и хронической токсичности по каждому биологическому объекту (икра, личинки, молодь, взрослые рыбы), рассчитывают характеристику опасности развивающегося токсического эффекта по отношению вероятностных смертельных концентраций. Наиболее полно отмечаемое явление характеризуется фактором угла наклона "доза - эффект" (S):

Оценка кумулятивного действия вещества проводится по коэффициенту функциональной кумуляции (К_кум), который определяется отношением острой среднелетальной концентрации, умноженной на фактор угла "доза - эффект", к хронической среднелетальной концентрации, умноженной на свой фактор:

Таблица 6.2.2

Оценка веществ по коэффициенту функциональной кумуляции (К_кум)

В зависимости от величины коэффициента функциональной кумуляции вещество относят к одной из четырех групп (Таблица 6.2.2), каждой из которых соответствует определенный коэффициент запаса (Кз_кум).

Кумулятивные коэффициенты запаса по степени накопления вещества в организмах (Кзн) и по степени накопления токсического эффекта (Кз_кум) используются при расчете ПДК для пестицидов (п. 3.1.4 Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям). Коэффициент материальной кумуляции (К_н) используется при установлении класса опасности вещества (п. 1.1 Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям).

6.2.4.13. Токсикологическая оценка исследованного вещества. При токсикологической оценке вещества в качестве обязательных используются наиболее общие показатели и признаки отравления рыб. По ним устанавливают максимальные допустимые концентрации испытуемого вещества, то есть концентрации, которые в хроническом опыте не вызывают никаких отклонений исследуемых показателей от контроля. Максимальные допустимые концентрации, установленные по каждому обязательному показателю, вносят в сводную таблицу по форме 9.

Форма 9

Сводная таблица допустимых концентраций для рыб

В качестве максимальной допустимой концентрации вещества для взрослых рыб принимается наименьшая концентрация из допустимых, установленных по каждому обязательному показателю.