Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Росрыболовства от 04.08.2009 N 695 "ОБ УТВЕРЖДЕНИИ МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ ПО РАЗРАБОТКЕ НОРМАТИВОВ КАЧЕСТВА ВОДЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ, В ТОМ ЧИСЛЕ НОРМАТИВОВ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОДАХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ"

7.6.1. Характеристика тест-объекта

Исследования проводятся на политенных хромосомах в слюнных железах предкуколки хирономид. В качестве тест-объекта рекомендуется лабораторная культура хирономид - хирономус тами и хирономус плумозус (Chironomus thummi и Ch. Plumosus). При исследовании вещества в соленой воде в качестве тест-объекта рекомендуется лабораторная культура хирономид (Chironomus sp.) из азовских лиманов, адаптированная к солености 20 промилле. В результате проведения работы выявляется действие веществ на структуру интерфазных хромосом и на дифференциальную активность проявления пуффинга в процессе метаморфоза личинки в куколку.

7.6.2. Оборудование и материалы:

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;

тонкий пинцет;

препаровальные иглы;

предметные и покровные стекла;

кисточка;

фильтровальная бумага;

краситель ацетоарсеин (0,5% арсеина в 45%-ной уксусной кислоте);

среда для заливки (краситель, разведенный в соотношении 1:3 45%-ной уксусной кислотой).

7.6.3. Проведение исследований

Определение генотоксичности химических соединений и их действия на дифференциальную активность генов проводят на предкуколке, развитие которой наблюдается с 36-го по 38-й день при температуре 20 - 25 °C. Стадия предкуколки характеризуется набуханием грудных сегментов, укорочением и заострением тела и уменьшением ложных ножек. Метаморфоз проходит в 6-й, 7-й, 8-й и 9-й фазах развития. Изменение цвета тела с красного на темно-серый указывает на окончание метаморфоза.

Для синхронизации развития и отбора хирономид в эксперименте заранее следят за степенью потемнения головы на первой фазе четвертого возраста, перед тем как личинка перейдет в фазу предкуколки. Отбирают личинок, у которых красный цвет головы меняется на темно-коричневый, и затем ждут момента набухания грудных сегментов и укорачивания тела. Препараты политенных хромосом из слюнных желез получают следующим образом. Личинку помещают на фильтровальную бумагу для обсушивания, затем переносят на предметное стекло, тонко отточенным пинцетом берут за мандибулы и тянут, отрывая голову. Вместе с головой из тела вытягивается кишечник, по бокам которого видны слюнные железы, прикрепленные к голове протоками. Препаровальными иглами слюнные железы отделяют от остальных тканей и окрашивают их в течение 10 - 15 мин. ацетоорсеином. После окрашивания слюнные железы изымают из красителя и помещают на чистое предметное стекло. На покровное стекло наносится капля среды для заливки. Покровное стекло переворачивают так, чтобы капля покрыла слюнные железы. На покровное стекло помещают кусочек фильтровальной бумаги и большим пальцем, без сдвигов в стороны, клетки слюнных желез раздавливают. Среда для заливки, выступившая из-под покровного стекла, впитывается в фильтровальную бумагу. Затем бумагу удаляют, а края покровного стекла смазывают бесцветным лаком. Благодаря лаку препарат предохраняют от высыхания.

7.6.4. Учет и анализ результатов

Генотоксичность вещества оценивается по нарушению структуры политенных хромосом (возможны разрывы, распад концов и дезинтеграция) и по нарушению пуфинга во время метаморфоза. Отмечается следующее образование пуфов в норме. На первой хромосоме пуф Gih-к увеличивается в размерах на 7-й и 8-й фазах развития. На второй хромосоме 2Азв постепенно сужается, а пуф 2Азе увеличивается на каждой последующей фазе. На 8-й фазе появляются 2 пуфа 2Д2де и пуф 2Г2. На третьей хромосоме на 6-й и 7-й фазах имеется пуф 3Дih, а после 7-й фазы появляется пуф 3Дif, который отмечается до конца метаморфоза. На четвертой хромосоме видны тельца Бальбиани, которые резко увеличиваются на 8-й фазе. Помимо этого на 6-й фазе появляется быстро исчезающий пуф 4Дс.

При действии некоторых токсикантов у личинок насекомых, имеющих политенные хромосомы, может возникнуть до 22 новых пуфов.