Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Росрыболовства от 04.08.2009 N 695 "ОБ УТВЕРЖДЕНИИ МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ ПО РАЗРАБОТКЕ НОРМАТИВОВ КАЧЕСТВА ВОДЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ, В ТОМ ЧИСЛЕ НОРМАТИВОВ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОДАХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ"

7.2.1. Характеристика тест-объекта

Гуппи (Poecilia reticulata Peters) - широко распространенная аквариумная живородящая рыбка. В природе встречается в соленых и пресных водах. Выдерживает значительные колебания солености.

Данный тест-объект широко применяется в международных и национальных стандартах при токсикологических исследованиях морей и внутренних морских вод.

Гуппи - мелкие рыбы с ярко выраженным половым деморфизмом. Самцы (3 - 4 см) обычно мельче самок и окрашены в более яркие цвета. В их окраске преобладают серовато-коричниевые тона с очень яркими красными, голубыми, зелеными и черными вкраплениями и точками. Самки достигают 6 см в длину, обычно желтовато-зеленые.

Гуппи выдерживают многократное близкородственное скрещивание, что облегчает получение чистых линий.

Для исследований используют гуппи, адаптированных к различной солености. Изменение солености от 0 до 20 промилле гуппи переносят без адаптации. Постепенная адаптация к океанической солености до 35 промилле занимает около двух недель.

7.2.2. Условия лабораторного содержания

Для содержания (культивирования) гуппи используют термостатированные аквариумы, обеспечивающие плотность посадки тест-объектов из расчета для молоди 1 экземпляр на 1 - 2 дм3, и для половозрелых рыб - 1 экземпляр на 5 дм3 воды. Аквариум размещают в помещении, не содержащем токсических паров или газов, заполняют отстоянной и проаэрированной в течение 7 суток морской водой необходимой солености. Искусственная морская вода для содержания гуппи должна отвечать следующим требованиям: pH 7,8 - 8,2, температура 25 - 27 °C. Воду в аквариуме аэрируют с помощью микрокомпрессоров. Каждые три дня часть воды (1/4 - 1/5 часть) заменяют свежей. Поддерживают первоначальный объем воды в аквариумах, доливая дистиллированную воду вместо испарившейся и контролируя соленость с помощью солемера. Ил со дна аквариума убирают регулярно при помощи сифона.

Кроме рыб в аквариум помещают зеленую водоросль энтероморфу, которая при хорошем освещении хорошо развивается и служит для гуппи укрытием и кормом.

Кормят гуппи 1 - 2 раза в сутки, производителей чаще, сухим (дафнии, циклопы) или живым кормом (мотыль, трубочник, дафнии, циклопы). Корм вносят в таком количестве, чтобы рыбы съедали его без остатка за 3 - 5 минут, так как излишки приводят к ухудшению качества воды в аквариуме. Особенно осторожно следует кормить рыб живыми дафниями и циклопами, которые в морской воде быстро погибают и могут служить источником сильного загрязнения.

Для получения молоди отбирают производителей в возрасте от 1 - 2 лет (продолжительность жизни гуппи в аквариумных условиях 3 - 3,5 года).

Самку готовят к вымету, помещая в отдельную термостатированную нерестовую емкость объемом не менее 4 дм3, заполненную водопроводной водой температурой 25 °C и большим количеством мелколистных растений. Готовность самки к вымету мальков определяют по наличию хорошо заметного темного пятна перед анальным плавником. При этом форма брюшка приближается к прямоугольной, и оно становится намного шире спины. Вымет происходит в искусственную или природную морскую воду (самок перед выметом переводят в аквариумы с морской водой).

После окончания вымета самок изолируют, так как они поедают потомство.

Мальки рождаются сформированными. Лучшим кормом для них является "пыль", состоящая из инфузорий, коловраток, молоди ветвистоусых рачков и науплиусов веслоногих рачков. При отсутствии "пыли" молодь гуппи кормят перетертыми сухими дафниями или любым другим измельченным сухим кормом. На 100 мальков вносят не более 1 г корма. По мере роста в рацион рыб вводят измельченный трубочник, мотыль, коретку и другой живой корм. Однодневных и двухнедельных мальков кормят до 5 раз в сутки, более взрослых 2 - 3 раза. Вносимые порции корма должны быть небольшими и поедаться рыбами в течение 3 - 5 минут.

Мальков сортируют по размерам и постепенно переводят из нерестовых аквариумов в вырастные (вначале объемом 50 дм3, а затем - 200 дм3). Мальки становятся половозрелыми в 4 - 6 месяцев.

Гуппи размножаются и растут при солености воды от 0 до 20 промилле без адаптации при их пересаживании. Для тестирования химических веществ в среде с соленостью выше 20 промилле получают исходный материал (мальков) в пресной воде (или в воде с соленостью до 20 промилле) с последующей адаптацией к более высокой солености.

7.2.3. Проведение исследований с гуппи возрастом 1 сутки

В опыте используют гуппи возрастом 1 сутки. Исследования проводят при освещении рассеянным светом, с естественной сменой дня и ночи, концентрацией кислорода в воде не менее 4 мг/дм3 и температурой воды 25 +/- 2 °C. Гибель рыбы в контроле не должна превышать 10%. Диапазон ответной реакции гуппи возрастом 1 - 2 суток (ЛК_50 за 96 часов) на эталонное вещество K2Cr2O7 находится в интервале 45 - 60 мг/л.

В аквариум наливают по 10 дм3 контрольной или тестируемой воды. Повторность трехкратная. В каждый аквариум помещают по 10 рыб. Воду в контрольных и опытных аквариумах аэрируют с помощью микрокомпрессоров. Ежесуточно в каждом аквариуме подсчитывают количество выживших рыб и удаляют погибших. Погибшими считают рыб, не подающих признаков движения или дыхания в течение 5 минут после прикосновения к ним стеклянной палочкой.

Для определения наличия острого токсического действия раствора вещества опыт проводят в течение 96 ч. Для определения наличия хронического токсического действия раствора вещества опыт проводят в течение 30 суток.

При кратковременном исследовании рыб не кормят.

При длительном исследовании смену воды в контрольных и опытных аквариумах проводят через 2 суток (или в соответствии со стабильностью тестируемого вещества в воде), один-два раза в сутки рыб кормят.

7.2.4. Определение влияния веществ на реальную плодовитость гуппи

При необходимости, для изучения влияния тестируемого вещества на реальную плодовитость гуппи, предварительно проводится подготовка тест-объекта.

Полученных от производителей мальков в течение 1 месяца выращивают в просторном аквариуме (на 1 малька - 1 дм3 воды). С появлением первых признаков половых различий, самцов отделяют от самок и продолжают выращивать в отдельных аквариумах. При температуре 25 - 27 °C через 6 месяцев все рыбы становятся половозрелыми. С этого момента их можно использовать в опыте.

За три дня до начала постановки опытов самцов и самок помещают в общий аквариум для спаривания. Соотношение самцов и самок 2:1. Однажды оплодотворенная самка может приносить приплод несколько раз.

Опыт длится до 30 суток. За это время при температуре 25 - 27 °C все самки рожают мальков.

Опыт проводят в трех повторностях. В каждый аквариум помещают по шесть самок. В процессе эксперимента рыб кормят живым кормом. В аквариумах устанавливаются садки с крупными ячейками, чтобы исключить поедание самками новорожденной молоди.

Показателем токсичности тестируемого раствора вещества служат выживаемость самок, реальная плодовитость (количество жизнеспособной молоди), количество мертворожденной молоди по сравнению с контролем.

Жизнеспособную молодь желательно проверить по показателю ЛК_50 для K2Cr2O7.