Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Росрыболовства от 04.08.2009 N 695 "ОБ УТВЕРЖДЕНИИ МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ ПО РАЗРАБОТКЕ НОРМАТИВОВ КАЧЕСТВА ВОДЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ, В ТОМ ЧИСЛЕ НОРМАТИВОВ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОДАХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ"

6.1.1. Характеристика тест-объекта

Мидия - широко распространенный вид двустворчатых моллюсков, образует две экологические морфы: скаловую и иловую. Скаловая мидия обитает в прибрежной зоне на каменистых субстратах в горизонте от сублиторали до глубин 20 - 25 м, образуя в верхнем 10-метровом слое сплошные поселения. Иловая морфа образует банки в открытом море на глубинах 35 - 75 м.

По показателю выживаемости мидия обладает высокой токсикорезистентностью ко многим типам загрязнения. Наряду с этим, пороговая чувствительность по некоторым показателям физиологической активности этого моллюска находится на уровне ПДК вещества для водных объектов рыбохозяйственного значения. Широкая распространенность и низкая смертность при изменении абиотических факторов позволяют легко добывать экспериментальный материал и содержать мидий в лабораторных условиях. В то же время повышенная чувствительность физиологических функций к действию токсикантов позволяет с большой точностью определять пригодность водной среды для жизнедеятельности моллюсков.

Для регистрации показателей токсичности используют следующие тест-функции: интенсивность потребления кислорода, биссусный тест, трофическая активность, степень агрегированности и скорость собирания в друзы.

Для проведения исследований наиболее пригодны молодые неполовозрелые мидии размером не более 30 мм, находящиеся в фазе активного роста. На этой стадии онтогенеза мидии обладают наибольшей двигательной, дыхательной и трофической активностью и меньше подвержены индивидуальным различиям, связанным с развитием гаметогенетического цикла.

Мидии легко культивируются в лабораторных условиях, что позволяет всегда иметь в лаборатории необходимое количество экспериментального материала, однако в лабораторных условиях не всегда удается создать наиболее оптимальные условия для обитания моллюсков. В связи с этим данный биотест ориентирован на применение в условиях морских лабораторий и полевых экспедиций, использующих живой материал непосредственно из моря.

На Черном море мидия размножается практически круглый год с ярко выраженными пиками в феврале - марте, апреле - мае и августе - сентябре. В планктоне личинки находятся от 8 до 14 суток в зависимости от температуры воды, затем оседают на различные субстраты. Молодь мидий размером 20 - 30 мм можно найти в водоеме практически круглый год.

6.1.2. Условия лабораторного содержания

При исследовании на мидиях используют следующее оборудование: респирометры;

термооксиметры модели UT-800, либо анализаторы параметров водной среды марки HORIBA, модель U-7;

счетная камера Нажотта;

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;

прибор для определения оптической плотности воды.

6.1.3. Отбор мидий для опыта

Друзы моллюсков, доставленные из моря, разбирают на отдельные особи, отделяют от обрастаний и детрита и тщательно промывают чистой морской водой. Отделять мидии друг от друга следует осторожно, во избежание повреждения биссусных желез и травмирования моллюсков. Срезают мидий с друзы маленькими ножницами, обрезая биссусные нити у основания раковины. Для отбора мидий в эксперимент и первичной оценки физиологического состояния анализируемой популяции, очищенных мидий помещают в аквариум с проточной водой на 15 - 25 минут и наблюдают за их двигательной активностью. Здоровые мидии размером 15 - 25 мм начинают шевелиться и пытаются перемещаться по дну аквариума с помощью ноги уже через 2 - 3 минуты после помещения в воду. По количеству двигающихся особей можно предварительно судить о состоянии популяции. В норме примерно 95% всех отобранных мидий проявляют двигательную активность в первые 5 минут.

6.1.4. Проведение исследований

При постановке опыта у каждой группы испытуемых моллюсков одновременно регистрируется несколько параметров физиологической активности. Для этого в качестве рабочей камеры рекомендуется использовать герметичные респирометры объемом 2 - 3 дм3 с большой площадью дна, на который размещаются датчики постоянной регистрации содержания кислорода, магнитная мешалка, пробоотборник проб воды для определения концентрации корма при выяснении трофической активности тест-объектов. В полевых условиях магнитная мешалка может быть заменена на электромотор (питаемый от аккумулятора или батареи и снабженный крыльчаткой), помещенный в воду. Если по схеме эксперимента дыхательная активность не измеряется, то перемешивание воды может осуществляться с помощью барбатации.

Число организмов в эксперименте 50 - 100 экземпляров. Количество параллельных серий 2 - 3.

Для определения влияния того или иного токсиканта на физиологическую активность мидий в респирометры наливают морскую воду, содержащую определенное количество испытуемого вещества. Выбор рабочих концентраций осуществляется по стандартной схеме токсикологического биотестирования, включая предварительный и окончательный этап эксперимента. Если необходимо провести оценку физиологического состояния мидий, взятых из определенного района побережья, то респирометры заливают природной морской водой, взятой из того же места, что и испытуемые мидии. Как в первом, так и во втором случае, воду перед заливкой в респирометры аэрируют не менее 30 мин. для полного насыщения кислородом. После заливки респирометров водой и их герметизации, включают магнитную мешалку. Измерения производят через 15 минут. Регистрируются следующие параметры:

а) концентрация кислорода в воде;

б) температура воды;

в) количество мидий, собравшихся в друзы (друзой считается группа соприкасающихся мидий, состоящая из трех или более экземпляров);

г) прикрепленность ко дну аквариума (определяют длинным проволочным щупом, пропускаемым через отверстие в крышке респирометра, которое после определения закрывают пробкой).

Длительность эксперимента определяется скоростью потребления кислорода. Опыт прекращается, когда концентрация кислорода в воде снижается по сравнению с исходной на 30%. Если дыхание происходит очень слабо, то длительность эксперимента следует ограничить до 4 - 5 часов, так как дальнейшая экспозиция может быть сильно замаскирована разложением детрита, выделяемого мидиями.

Для проведения экспериментов, в схему которых включено измерение трофической активности мидий, предварительно готовят кормовую смесь. Обычно это суспензия микроводорослей различных видов, либо гомогенат талломов макрофитов. Опыты по определению трофической активности мидий ведутся без измерения потребления кислорода. Аэратор, работающий на малом режиме, остается в аквариуме на все время эксперимента, так как снижение концентрации кислорода в воде блокирует трофику мидий.

Определенное количество микроводорослей либо определенную навеску гомогената помещают в рабочий аквариум с равномерно размещенными мидиями и тщательно перемешивают с помощью аэратора.

Аликвоты для измерения концентрации пищи в среде отбирают через каждые 5 мин. Все остальные параметры снимают через каждые 15 мин. Аликвоты либо фиксируют для дальнейшего просчета клеток под микроскопом (в случае кормления водорослями), либо помещают в счетную камеру прибора для измерения оптической плотности (в случае кормления гомогенатом). Исходная концентрация корма зависит от разрешающей способности применяемой аппаратуры.

6.1.5. Учет и анализ результатов

На основании экспериментальных данных по стандартным статистическим и биометрическим методикам обрабатывают полученные показатели физиологического состояния мидий. Определяют:

а) интенсивность дыхания - потребление кислорода в единицу времени на единицу биомассы и на одну особь; 2) степень агрегированности - отношение числа особей в друзах к общему числу особей в опыте выражают в процентах;

б) скорость прикрепления к субстрату - время, за которое 50% особей прикрепились ко дну рабочего аквариума;

в) трофическую активность - количество корма, потребленного одной особью за единицу времени.

Сравнивая показатели, полученные у мидий, взятых в качестве контроля, с показателями, полученными у мидий, подвергшихся действию химического вещества, можно оценить степень нарушения физиологического состояния мидий и сделать заключение о токсичности растворов вещества.