Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава РФ от 26.03.2001 N 87 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА"

В день постановки опыта проводят подготовительную работу (сливание испытуемых сывороток крови со сгустка, их инактивация, отмывание эритроцитов барана от плазмы крови, приготовление изотонического раствора натрия хлорида). Разводят ингредиенты: гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, антигены по титру. Определяют рабочую дозу комплемента титрованием без антигенов, в присутствии антигенов.

Исследование каждой испытуемой сыворотки крови проводят в трех пробирках с двумя антигенами (таблица N 5). Одновременно исследуют для контроля заведомо положительные (4+, 2+) и отрицательную сыворотки крови. Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1:5 изотоническим раствором натрия хлорида, разливают по 0,25 мл в три пробирки, из которых третья является контрольной. В первую пробирку добавляют по 0,25 мл трепонемного антигена, во вторую - 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенных по титру. В третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Комплемент разведенный по рабочей дозе, добавляют по 0,25 мл во все опытные и контрольный пробирки. Предварительное смешивание антигена и комплемента не рекомендуется. После первичной 45 - минутной инкубации в термостате при 37 град. С добавляют во все пробирки по 0,5 мл гемолитической системы. Легким встряхиванием перемешивают содержимое пробирок и помещают их в термостат при 37 град. С на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке. Регистрируют результат реакции по наличию или отсутствию гемолиза в опытных пробирках.

Оценка результатов

Для обозначения степени позитивности реакции Вассермана пользуются системой четырех плюсов:

Полная задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - 2+ (слабоположительная реакция); незначительная задержка гемолиза - 1+; сомнительная реакция -+/-. Отрицательный результат реакции характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта.

Таблица N 5

КАЧЕСТВЕННАЯ МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

Оценку результатов регистрируют в книге протоколов лаборатории.

Результаты реакции следует давать по каждому антигену отдельно.

В случае расхождения результатов между антигенами необходимо повторить исследование новой порции сыворотки крови. Особое внимание следует обращать на образцы сыворотки крови, дающие положительный результат в РСК с трепонемным антигеном и отрицательный результат с кардиолипиновым и в МР. Поскольку трепонемный антиген является специфическим следует исследовать данную сыворотку крови в специфических тестах, в частности в РПГА из-за простоты ее постановки и быстрого получения результата.

После лечения больных по поводу сифилиса РСК с трепонемным антигеном, как и другие специфические тесты, может длительное время оставаться позитивной.

Повторное исследование необходимо также при наличии задержки гемолиза в контроле сыворотки крови (третья пробирка, не содержащая антигена).

Правильность течения опыта оценивают на основании следующих результатов:

- контроля испытуемой сыворотки крови - третий ряд пробирок (отрицательный);

- контроля с заведомо отрицательной сывороткой крови (отрицательный);

- контроля с заведомо положительной (3+ или 4+) и слабоположительной (2+) сыворотками крови.

В качестве контрольных используют лиофилизированные сыворотки крови.

Сыворотки крови положительные и слабоположительные получают из крови кроликов, зараженных патогенными бледными трепонемами (штамм Никольса), отрицательные - из крови здоровых кроликов.

Сухие сыворотки крови выпускают в ампулах по 1 мл. В день постановки реакции сыворотку крови растворяют добавлением изотонического раствора натрия хлорида для восстановления первоначального (до высушивания) объема.

После полного растворения сыворотки крови инактивируют при 56град. С в течение 30 минут. Положительные и слабоположительные сыворотки крови должны давать задержку гемолиза на 4+ и 2+ соответственно при разведении 1:5 по качественной методике постановки реакции Вассермана с кардиолипиновым и трепонемным антигенами.

Если рабочая доза комплемента выбрана неправильно (избыток комплемента), то со слабоположительной сывороткой крови будет получен отрицательный результат реакции; при недостатке комплемента наблюдается задержка гемолиза с контрольной отрицательной сывороткой крови и в контроле испытуемых сывороток крови (3-й ряд пробирок).

Источники ошибок:

- нарушение условий и методики постановки реакции;

- несоблюдение условий и срока хранения испытуемой сыворотки крови, антигенов, комплемента, эритроцитов барана;

- изменение процентного содержания натрия хлорида;

- неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте);

- исключение из постановки реакции контрольных положительных и слабоположительных сывороток крови;

- использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.