Законодательная база Российской Федерации

"МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ ПОЧВЫ" (утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 19.02.81 N 2293-81) (извлечение)

Сущность метода заключается в наблюдении под микроскопом с фазовым контрастом за ростом и размножением чистых культур микроорганизмов на специально приготовленных агаровых пластинках. Питательные среды, соответствующие для изучаемых видов микроорганизмов, расплавляют и разливают в стерильные пробирки по 10 мл. Расчет рабочих концентраций химических веществ производится следующим образом: не больше 1 мл раствора на 10 мл питательной среды. Одна пробирка каждой серии является контрольной - без химических соединений. После внесения химических веществ все пробирки ставят на водяную баню, для поддержания температуры в пределах 50 - 70 град. C. Чистые предметные стекла прожигают над пламенем горелки, затем на них из пробирок наносят тонкий слой (0,5 - 1 мм) питательной среды. Параллельно, на покровное стекло пастеровской пипеткой наносится небольшая капля суспензии клеток тест - микроорганизма определенной концентрации (для энтеробактерий оптимальная концентрация 200 млн./мл, для дрожжей - 50 млн./мл). Покровное стекло с нанесенной каплей бактериальной взвеси переворачивается и опускается на поверхность тонкого слоя агара. Капля под покровным стеклом растекается на всю его площадь. Результаты проведенных опытов показали, что для получения ответа на статистически достоверном уровне достаточно просмотреть один препарат при подсчете не менее 100 микроколоний и единичных клеток. Наблюдение под микроскопом производится после инкубировання в термостате в течение времени, необходимого для каждого вида микроорганизмов и охлаждения их в холодильнике при температуре 6 - 10 град. C в течение 10 - 15 мин. Из термостата вынимают все слайды (опытные и контрольные) одновременно. Просмотр проводят по диагонали препарата с увеличением 40x7. При таком увеличении в поле зрения попадает 20 - 25 клеток, которые легко поддаются учету.

Разработаны критерии учета антибактериальных свойств химических веществ. К ним относятся: 1) процент жизнеспособных клеток; 2) интенсивность размножения - показывающая, с какой скоростью делится популяция за определенный промежуток времени; 3) длительность лаг - фазы; 4) морфологические изменения отдельных клеток и микроколоний.

Показатель жизнеспособности - это удельный вес размножившихся клеток микроорганизмов опытных серий (с токсическими соединениями) по сравнению с контролем в аналогичных условиях без внесения изучаемого соединения. Для получения результатов с точностью на уровне 96% необходимо в каждом препарате просмотреть не менее 400 микроколоний и единичных клеток. Время инкубации определяется опытным путем для каждого вида микроорганизмов. Для ряда видов микроорганизмов время инкубации установлено, а именно: для микроорганизмов кишечной группы - 3 часа; Cl. perfringens - 4 часа; Micrococcus - 3,5 - 5 часов; Rh. gracilis - 7 часов.

Целесообразно, на основании показателя жизнеспособности, определять процент ингибирования, который высчитывается вычитанием от 100 процента жизнеспособности.

Интенсивность размножения является вторым важным показателем влияния токсических соединений на микроорганизмы и определяется следующим образом. После определения первого показателя (жизнеспособность или процент ингибиции) в нескольких полях зрения подсчитывается общее количество клеток во всех микроколониях контрольных и опытных препаратов. Подсчету подлежат и отдельные неразмножавшиеся клетки. Общее количество подсчитываемых отдельных клеток и микроколоний должно быть не менее 100. После, на основании получаемых величин, высчитывается степень подавления или стимуляции выражаемой в процентах по сравнению с контролем. Для этого в контроле и опытных препаратах определяется среднее количество клеток в одной микроколонии. Среднее количество клеток в микроколониях контрольного препарата принимается за 100%.

Одновременно, без дополнительных опытов, на тех же препаратах, можно определить и другой показатель - морфологические изменения микроорганизмов под действием токсических веществ и соединений. В контрольных препаратах отдельные клетки и клетки в микроколониях располагаются в определенном, характерном для каждого вида, порядке, в одной полости, имеют четкое очертание. При выращивании тест - микроорганизмов на питательных средах, содержащих токсическое соединение, наблюдаются морфологические изменения как отдельных клеток, так и микроколоний.

Культурально - морфологическим методом определяется еще один показатель антибактериального действия химических веществ на микроорганизмы - лаг - фаза. Для определения длительности лаг - фазы готовится не один, а несколько препаратов (5 - 6 и более) контроля в каждой концентрации изучаемого химического соединения. Это необходимо для того, чтобы просмотреть контрольный и опытные препараты в динамике - через определенные промежутки времени инкубации. Для этого, с учетом лаг - фазы каждого вида микроорганизма, определяют периодичность просмотра препаратов. Например, если лаг - фаза микроорганизмов находится в пределах 1 часа, то целесообразно препараты просматривать каждые 10 - 15 минут, если 2 - 3 часа и более - каждые 30 минут или 1 час. Общее время наблюдения не должно превышать срок наблюдения при определении первого показателя - жизнеспособности.

Длительность лаг - фазы равна времени от начала инкубации до появления 1 - 3 микроколоний, состоящих из 4 и более клеток и выражается в часах и минутах. Общим требованием, при определении этого показателя, является просмотр всех препаратов (контрольных и опытных) через равные промежутки времени. Для этого, если невозможно их учесть в течение нескольких минут, препараты помещают в холодильник, чтобы прекратить размножение популяции микроорганизмов.

Результаты выражаются в абсолютных (время лаг - фазы в минутах) или относительных (процент удлинения или сокращения лаг - фазы микроорганизмов под действием токсических веществ по сравнению с контролем) показателях.

Для получения в короткие сроки данных о действии химических веществ на микроорганизмы могут использоваться методы определения дыхания, ферментативной активности и показатели начальных этапов роста микроорганизмов. Эти методы позволяют сократить время исследований до нескольких часов.

Исследование проводят в аппарате Варбурга. В пробирки с соответствующей питательной средой, содержащей заданные концентрации изучаемого вещества, вносят тест - микроорганизм. Действие вещества оценивают по разности выделяемого углекислого газа в контроле и опыте.

Определение основано на способности ферментов микроорганизмов - дегидрогеназ восстанавливать за счет дегидрирования субстрата бесцветный трифенилтетразолийхлорид (ТТХ) до формазана (трифенилформазана), имеющего темно - красный цвет. Дегидрогеназы высоко чувствительны к действию биологических ядов, в присутствии которых их активность снижается. Это позволяет путем сравнения количества восстановленного дегидрогеназами микроорганизмов ТТХ в опытах и контроле оценить степень токсичности исследуемого вещества.

Ход определения. Готовят в физиологическом растворе густую суспензию тест - микроорганизмов из суточной культуры на скошенном агаре. Бактериальные клетки осаждают центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 мин. (Экспозиция установлена для кишечных палочек и сибиреязвенных бацилл.) Надосадочную жидкость сливают, а клетки отмывают от посторонних примесей 3 - 4 раза водопроводной водой или физраствором при той же скорости и времени центрифугирования. Из отмытых клеток готовят стандартную суспензию в физрастворе с постоянной плотностью, соответствующей показанию ФЭК 0,32 - 0,34. Плотность суспензии определяют на ФЭКе в кюветах 5 мм, при зеленом светофильтре.

В химически чистые сухие пробирки вносят в указанной последовательности следующие растворы: 1,2 мл 1/15 Na2HPO4, 0,5 мл 0,1 М глюкозы (субстрат для дегидрирования), 0,1 мл 0,1 М MgSO4, 0,2 мл 0,5% трифенилтетразолийхлорида (ТТХ), 1 мл бактериальной суспензии и исследуемое вещество в количестве, создающем необходимую его концентрацию в пересчете на 1 л. Общий объем реакционной смеси должен быть равен 3 мл. Смесь инкубируют в термостате при 37 град. C в течение 2 часов до появления окраски формазана.

Для извлечения формазана клетки разрушают ледяной уксусной кислотой, которую добавляют по 3 мл в каждую пробирку. Из реакционной смеси формазан экстрагируют толуолом (3 мл в каждую пробирку). Для полного извлечения формазана из реакционной смеси пробирки несколько раз встряхивают и отстаивают. На полноту извлечения формазана указывает обесцвечивание реакционной смеси. Формазан очень осторожно, с помощью пастеровской пипетки, переносят в кюветы для колориметрирования. Колориметрируют в кюветах 3 мл при сине - зеленом светофильтре (с фильтром 490 нм). Качество образованного бактериями формазана рассчитывают по калибровочной кривой. Исследования проводят не менее чем в пятикратной повторности для статистической обработки полученных материалов. При этом значение доверительного коэффициента и в зависимости от этого показателя оценивают действие испытанной концентрации вещества.

Для построения калибровочной кривой готовят растворы формазана различной концентрации. Для приготовления основного раствора к 10 мг трифенилтетразолийхлорида добавляют 100 мг гидросульфита натрия и 2 - 5 мл фосфатного буфера с pH 7,4. Образовавшийся осадок формазана доводят толуолом до объема 20 мл. Основной раствор содержит 1000 мг формазана в 2 мл. Из основного раствора путем сочетания его различных объемов с толуолом готовят стандартные растворы с концентрацией формазана от 5 мкг до 500 мкг. Светопоглощаемость стандартных растворов измеряют на ФЭКе и по полученным данным строят кривую.

Метод оценки токсичности веществ по дегидрогеназной активности бактерий имеет ряд преимуществ. К их числу относят: экспрессность анализа, высокую чувствительность, высокую производительность, позволяющие иметь большое число повторностей для статистической обработки результатов, возможность количественно выразить эффект действия вещества.

Данное определение позволяет ограничить наблюдения первыми периодами развития популяции - лаг - фазой и фазой роста по экспоненте (логарифмический рост).

Изучение роста микроорганизмов только на первых этапах их развития, без длительных наблюдений в течение 1 - 10 суток обосновано экспериментально и является следствием прямой зависимости численной характеристики популяции от особенностей ее начального роста.

Для оценки токсичности вещества определяют время (в часах) лаг - фазы и фазы логарифмического роста исследуемого микроорганизма в присутствии вещества и в контроле. Изменение этих периодов роста указывает на токсический эффект изучаемого вещества, выражающийся в увеличении времени лаг - фазы и сокращении продолжительности фазы логарифмического роста.

Для исследования готовят на физиологическом растворе суточную взвесь тест - микроорганизма с концентрацией 1 млрд./мл. Методом убывающих разведений концентрацию микроорганизмов снижают до 200 - 300 клеток в мл. Последнее разведение готовят во флаконе с питательной средой и вносят в него изучаемое вещество в заданной концентрации. Посевы инкубируют при оптимальной для тест - микроорганизма температуре. Каждый час от момента посева и на протяжении первых часов роста определяют численность микроорганизмов общепринятым методом: глубинного или поверхностного посева на соответствующие питательные среды. По результатам ежечасного учета численности микроорганизмов строят кривую роста и определяют длительность лаг - фазы, т.е. время в часах от момента посева до первого удвоения исходной численности популяции. Для установления периода логарифмического роста рассчитывают время генерации микроорганизмов за каждый час после завершения лаг - фазы. Время генерации определяют по формуле:

где: g - время генерации, t - время наблюдений, В - число бактерий к концу опыта, в - начальное число бактерий. Период логарифмического роста устанавливают по продолжительности развития популяции с одинаковой скоростью (время генерации).

По разнице (в часах) указанных периодов роста в опыте и контроле определяют токсические для тест - микроорганизмов концентрации исследуемого вещества. Продолжительность исследования начальных периодов роста составляет 2 - 6 часов при испытании в мясо - пептонных средах и 10 - 12 часов при исследовании в воде. При необходимости исследования могут быть ограничены не только определением продолжительности лаг - фазы роста микроорганизмов.