Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Росрыболовства от 04.08.2009 N 695 "ОБ УТВЕРЖДЕНИИ МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ ПО РАЗРАБОТКЕ НОРМАТИВОВ КАЧЕСТВА ВОДЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ, В ТОМ ЧИСЛЕ НОРМАТИВОВ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОДАХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ"

6.1.1. Вводные замечания

Контролируются эмбриональное развитие рыб в исследуемой воде, выклев свободных эмбрионов (предличинок) и выживаемость предличинок после выклева. Из литературных источников и из опыта нормирования известно, что эмбрионы рыб и предличинки более чувствительны к токсическому воздействию по сравнению со взрослыми особями.

В настоящих Методических указаниях описан порядок работы с аквариумной рыбкой данио рерио, но наряду с этим видом могут быть использованы вьюн, осетр, форель и др.

6.1.2. Характеристика тест-объекта

В качестве тест-объекта для определения ПДК вещества по эмбриональному развитию удобно использовать икромечущую аквариумную рыбу данио Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), поскольку материал для исследования можно получать в течение всего года, независимо от периодичности работы рыбоводных заводов. В природе данио обитает в медленно текущих водных объектах Юго-Восточной Азии. Длина взрослых рыб до 4,5 см. Тело цилиндрической формы, серебристое с 7 - 9 темно-синими горизонтальными полосами. Полосы идут к хвостовому и анальному плавникам. Спина окрашена в оливково-зеленый цвет.

6.1.3. Условия лабораторного содержания

Для содержания рыб-производителей могут быть использованы аквариумы объемом от 25 дм3, заполненные отстоянной водопроводной водой с температурой 22 °C. Для кормления может быть использован сухой корм, но при подготовке к нересту необходимы живые корма (дафния, циклоп, мотыль, отмытый трубочник).

Для получения икры самок и самцов отделяют друг от друга и кормят живым кормом. Плотность посадки рыб в этот период не отличается от обычного содержания. В конце второй недели самцы приобретают густой золотистый блеск, а брюшко самок значительно увеличивается в объеме за счет икры. Наиболее подготовленных к нересту рыб отлавливают и помещают в нерестовый аквариум.

Нерестовый аквариум наполняют свежей отстоянной водой с жесткостью не более 4,0 мг экв/л, с температурой около 27 °C и pH 6,8 - 6,9. В аквариум должна быть помещена сетка с ячеями 3 мм, которая служит для предохранения от поедания икры и личинок рыб взрослыми рыбами. Отложенная оплодотворенная икра опускается на дно, проходит сквозь сетку и становится недоступной для рыб. При размещении сетки следят, чтобы над сеткой осталось не менее одного литра воды для плавания производителей.

В нерестовый аквариум утром помещают самок и кормят сухим кормом, а вечером в этот же аквариум помещают по 2 - 3 самца на каждую самку, еще раз кормят всех рыб, а затем выключают свет. Стимулом к нересту служит утреннее включение света.

Обычно выклев у данио завершается через 48 ч после нереста, а еще через 48 ч предличинки начинают переходить на активное питание и становятся личинками. Переход предличинок на активное питание завершает данный этап исследований.

6.1.4. Проведение исследований

Для определения ПДК вещества на эмбрионах и личинках рыб ведут наблюдение за эмбриональным развитием данио и выклевом предличинок в контроле и исследуемых концентрациях веществ. После нереста взрослых рыб отсаживают, а оплодотворенные икринки помещают в чашки Петри. В каждую чашку с отстоянной водой (контроль) и с исследуемыми растворами помещают по 10 икринок. Концентрации исследуемого вещества готовят с шагом либо на порядок, либо в арифметической прогрессии, ориентируясь на максимальные допустимые концентрации вещества, полученные в опытах на других организмах. Исследование каждой концентрации проводится в трехкратной повторности.

Выклюнувшиеся предличинки помещаются по 10 штук в контрольную и тестируемую воду. Наблюдение ведется, как и в первом случае, в чашках Петри, которые должны находиться в термостатируемых условиях. Длительность эксперимента определяется переходом личинок на активное питание.

6.1.5. Учет и анализ результатов

Основными показателями токсичности вещества являются выживаемость эмбрионов и личинок, морфометрические параметры, тератологический анализ. В качестве дополнительных показателей эмбриотоксикологической оценки влияния исследуемых веществ могут служить биохимические исследования (например, липидный и белковый обмен у эмбрионов и предличинок рыб).

В опытах через каждые 6 ч учитывают состояние тест-объекта и ход выклева. Учитывается оплодотворение икры, а также гибель и морфологические изменения у эмбрионов в процентах по отношению к контролю.

Процент оплодотворения выявляется уже через сутки после нереста. Неоплодотворенные икринки белеют и легко отличаются от нормально развивающихся, которые остаются прозрачными.

Становятся белыми также и погибшие эмбрионы вследствие коагулирования белка. Гибель эмбрионов бывает наибольшей в начале и в конце эмбрионального периода.

Выклев - наиболее чувствительный и важный этап, завершающий эмбриональное развитие у рыб. Эмбрионы, достигшие стадии выклева, в результате действия токсичного агента часто оказываются неспособными выйти из оболочек и погибают. Важным показателем является распределение выклева на весь период эмбрионального развития. Если под влиянием токсикантов нарушается эмбриональное развитие, то максимум выклева смещается по сравнению с контролем или растягивается во времени.

Морфометрические исследования лучше всего проводить на выклюнувшихся предличинках. У эмбрионов вредные воздействия веществ могут вызывать морфологические изменения, которые служат в качестве интегрального показателя эффекта действия вещества. Появление уродств свидетельствует о тератогенном действии. Уродливые эмбрионы, погибшие во время эмбрионального развития, включаются в число погибшей икры, а средний процент уродств подсчитывается после выклева и прохождения стадий предличинки.

Личинки, которые способны нормально плавать и переходят на активное питание, считаются выжившими. Нормальными считаются особи, не имеющие морфологических отклонений и не отличающиеся размерами от контрольных.

В качестве максимальной допустимой концентрации вещества для ранних стадий онтогенеза рыб принимается максимальная концентрация, не вызывающая статистически достоверного повышения смертности эмбрионов и личинок, увеличения числа особей с дефектами развития или отставания личинок в размерах и темпах развития.