Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 117 "О РЕАЛИЗАЦИИ "ПРОГРАММЫ ЛИКВИДАЦИИ КОРИ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ К 2010 ГОДУ"

Для лабораторной диагностики кори используются серологические методы исследования, основанные на выявлении вирусспецифических антител в одной или парных сыворотках крови.

В лабораторной сети Европейского региона для диагностики кори рекомендуют использовать метод иммуноферментного анализа (ИФА), предназначенный для обнаружения в сыворотке крови вирусспецифических LgM-антител, в редких случаях - LgG-противокоревых антител.

LgM-ИФА обладает высокой специфичностью и чувствительностью, требует для исследования одного образца сыворотки. Метод легко осуществим в лабораториях на местах, обеспечивает получение быстрых и достоверных результатов, на которые можно ориентироваться при проведении надзора за корью.

Только в случае получения сомнительных результатов в LgM-ИФА целесообразно использовать LgG-ИФА, однако при этом необходимо иметь для исследования две сыворотки, полученные от больного в активной фазе заболевания (4 - 5 день сыпи) и в период реконвалесценции (2-ую сыворотку допускается брать через 1 - 2 недели, но не позже 1,5 мес. с момента заболевания).

1.1. Техника взятия, маркировка и регистрация проб крови

Для серологической диагностики кори можно использовать как капиллярную, так и венозную кровь.

Капиллярную кровь берут из пальца в асептических условиях. Перед взятием крови кисть руки пациента согревают горячей водой, затем насухо вытирают чистым полотенцем. Палец, протерев 70 °C спиртом, прокалывают стерильным скарификатором одноразового пользования. Кровь в количестве 1,5 - 2,0 мл собирают в стерильную одноразовую центрифужную пробирку (или в специальные микропробирки для взятия капиллярной крови). После взятия крови место укола смазывают йодом, а пробирку закрывают резиновой пробкой.

Кровь из вены в количестве 5 мл берут стерильным шприцем в стерильную пробирку в строго асептических условиях, используя для этого специальное помещение, полностью соответствующее санитарно-эпидемиологическим требованиям.

На пробирку с кровью следует наклеить этикетку (лучше пользоваться полоской лейкопластыря) с указанием регистрационного (порядкового) номера, фамилии, имени, даты взятия крови.

При проведении серомониторинга к образцам крови (сыворотки) прилагается аккуратно заполненный сопроводительный документ "Список лиц, подлежащих серологическому обследованию" (Приложение 5), в котором указывают город (район); N детского дошкольного учреждения и группы: школы и класса; название вуза, факультета, группы; регистрационный (порядковый) номер (должен совпадать с номером на этикетке на пробирке с кровью), фамилию и имя пациента; дату рождения; дату вакцинации и ревакцинации ЖКВ; дату взятия крови; подпись ответственного лица.

При обследовании заболевшего корью или подозрительного на эту инфекцию заполняется "Направление в лабораторию регионального центра" и пробы крови (или сыворотки) направляются в лабораторию ЦГСЭН субъекта Федерации не позднее 48 часов с момента взятия крови (Приложение 2).

На месте сбора образцов сывороток крови следует хранить дубликаты списков обследованных лиц и результаты исследования сывороток в течение не менее 1 года.

1.2. Техника первичной обработки крови

Для получения сыворотки пробирку с кровью оставляют в наклонном (под углом 10° - 20°) положении при комнатной температуре на 30 минут для образования сгустка, после чего пробирку с кровью встряхивают (для отделения сгустка от стенки пробирки), закрывают пробкой и ставят на ночь в холодильник при температуре +4° - 8 °C.

После отделения сыворотки от сгустка (пробирки можно обвести по внутренней поверхности пастеровской пипеткой), ее центрифугируют при 500 g (1500 об./мин.) в течение 7 - 10 минут. Затем сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные центрифужные (пластиковые) пробирки (или эппиндорфы) с обязательным переносом на них этикетки с соответствующей пробирки.

Если в лаборатории нет центрифуги, то цельную кровь надо оставить в холодильнике до тех пор, пока не произойдет полная ретракция сгустка (отделение сгустка эритроцитов от сыворотки). Осторожно, тщательно избегая повреждения эритроцитов, перенести сыворотку в другую стерильную пробирку, снабженную этикеткой. Сыворотка должна быть прозрачной, светло-желтого цвета, без выраженного гемолиза.

Поступившие в лабораторию ЦГСЭН в субъекте Российской Федерации сыворотки можно хранить до передачи в вирусологическую лабораторию регионального центра в бытовых холодильниках при температуре +4 °C не более 7 дней.

Исследование сывороток осуществляется в вирусологической лаборатории регионального центра, где они должны храниться замороженными при температуре -20 °C в течение 1 года. Многократное замораживание и оттаивание сыворотки не допускается, в связи с чем сыворотку перед замораживанием необходимо разлить в несколько эппиндорфов по 0,25 мл.

1.3. Транспортировка образцов сыворотки (крови)

Перед транспортировкой собранного материала очень важно принять меры предосторожности: проверить наличие маркировки и сопроводительной документации (аккуратно заполненные этикетки на пробирках, списки и направления), прочно закрыть пробирки пробкой, расположить пробы согласно их номерам, уложить сыворотки в пластиковый пакет.

Для транспортировки крови (сыворотки) следует использовать термоконтейнеры (сумки-холодильники, термос, пенопластовую коробку). Если используются холодильные элементы (они должны быть заморожены), то положите их на дно и по бокам контейнера (коробки), а затем внутрь поместите пластиковый пакет с образцами сыворотки, а сверху вновь положите замороженные элементы. Сопроводительные документы (списки и направления на лабораторное исследование), указав время и дату отправления, поместите в полиэтиленовый пакет, положите его под крышку термоконтейнера или коробки.

Когда приготовления к отправке будут закончены, проинформируйте получателя о времени и способе транспортировки. При пересылке проб железнодорожным или воздушным транспортом лабораторию необходимо известить (по телефону, телеграммой) о номере поезда и вагона (рейса), дате и времени отправки и прибытия, количестве проб и пр.

При транспортировке образцов цельной крови в зимнее время года следует особенно следить за ее сохранением, не допуская замораживания.

Образцы крови должны быть доставлены как можно скорее. Не ждите, пока образцы накопятся!

1.4. Обработка медицинского инструментария

Обработка лабораторного инструментария и перевязочного материала, а также сбор и утилизация отходов медицинского назначения осуществляются в соответствии с действующими нормативными документами.

В ходе реализации эпиднадзора за корью на этапе ее элиминации необходимо наладить слежение за циркуляцией вируса с помощью идентификации штаммов вируса кори и генетической характеристики вирусных изолятов.

Вирус кори можно выделить в продромальной стадии заболевания и в стадии высыпания из различных материалов от больного: из мочи, назофарингеальных секретов и из лимфоцитов периферической крови. Интенсивность экскреции вируса быстро падает. Обнаружение и идентификация вируса кори на культуре клеток занимает несколько недель. Эти исследования должны проводиться на базе Национального центра по надзору за корью для слежения за биологическими свойствами циркулирующих на территории России штаммов вируса кори.

Выделение изолятов вируса кори позволяет в дальнейшем проводить их генетический анализ и сравнивать штаммы, полученные из различных мест в разные годы. Таким образом можно получить исчерпывающую информацию об их происхождении и проследить пути передачи вируса. Для проведения молекулярно-эпидемиологического анализа надо иметь коллекции местных штаммов вируса из эндемичных стран.

Выделение вируса - это достаточно дорогостоящий и трудоемкий метод, который занимает много времени и требует наличия вирусологической лаборатории, оборудованной специально для работы с культурами клеток и выделения вирусов. Вирус кори чрезвычайно чувствителен к повышению температуры. Поэтому образцы материалов, предназначенные для выделения вируса, должны быть транспортированы в лабораторию как можно быстрее и в условиях строгого соблюдения холодовой цепи.

Сбор и транспортировка вируссодержащих образцов проводится на базе региональных центров по надзору за корью.

2.1. Сбор, транспортировка и хранение образцов мочи

Для исследования берут пробы мочи в объеме 10 - 50 мл. Целесообразно использовать первую утреннюю порцию мочи, содержащую большее число эпителиальных клеток, из которых, как правило, и выделяется вирус кори. Наиболее успешно удается выделение вируса из образцов мочи, полученных на самых ранних стадиях болезни - в момент появления сыпи и максимум в течение 5 дней от момента высыпания.

Мочу собирают в стерильную емкость, охлаждают до +4 - 8 °C, центрифугируют в ближайшие несколько часов после забора. Центрифугирование проводят при 500 g (1500 об./мин.) в течение 5 мин. при +4 °C. Надосадочную жидкость выливают, а осадок ресуспендируют в 1 мл вирусной транспортной среды (см. Примечание) или питательной среды для культур клеток (RPMI, ИГЛА и другие).

Ресуспендированный осадок может храниться при температуре 4 °C не более 48 часов перед доставкой его в Национальный центр по надзору за корью или другую лабораторию, занимающуюся молекулярно-генетическим типированием вируса кори. В противном случае осадок должен быть заморожен в транспортной вирусной среде при -70 °C и отправлен с сухим льдом в герметично закрытых пробирках, предохраняющих этот осадок от воздействия углекислого газа.

В герметично закрытых емкостях, при 4 °C, можно транспортировать образцы цельной мочи, но лучше мочу отцентрифугировать в течение 24 часов после сбора и транспортировать ресуспендированный осадок.

Ресуспендированный осадок не следует замораживать, если можно его отправить на исследование в течение ближайших 48 часов.

Образцы мочи не следует замораживать до окончания процедур концентрирования.

2.2. Сбор, транспортировка и хранение назофарингиальных образцов

Назофарингиальные образцы (образцы носоглоточных смывов) должны быть взяты у больного как можно раньше, не позднее пятого дня с момента появления сыпи. В это время в этих образцах будет наиболее высокая концентрация вируса.

Назофарингиальные образцы могут быть взяты у больного одним из следующих способов, перечисленных в порядке возможности выделения вируса:

Аспирация носового секрета. Производится путем введения в нос 2 - 3 миллилитров стерильного физиологического раствора шприцем через надетый на него тонкий резиновый зонд, после чего жидкость отсасывают и помещают в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой, в которой находится специальная транспортная среда для вирусов.

Полоскание (промывные воды). Со слизистых оболочек носоглотки получают путем полоскания горла небольшим количеством физиологического раствора (2 - 3 мл); промывные воды вносят в транспортную среду для вирусов.

Назофарингиальные смывы. Для взятия используют ватный тампон, которым протирают слизистую оболочку носоглотки с достаточным усилием, чтобы снять часть эпителиальных клеток. Тампоны помещают в маркированные стерильные пробирки с завинчивающимися крышками, в которых содержится 2 - 3 мл транспортной среды для вирусов.

Образец носового секрета, взятого любым из перечисленных выше способов и помещенного в вирусологическую транспортную среду <*>, должен быть доставлен для исследования в течение 48 часов на холоде (при температуре 4 - 8 °C). Если условия не позволяют быстро отправить образец смыва из носоглотки, пробирку с тампоном следует энергично встряхнуть так, чтобы смыть клетки, а затем извлечь тампон. Назальные аспираты или смывы центрифугируют при температуре 4 °C при 500 g (1500 об./мин.) в течение 5 минут, затем осадок ресуспендируют в 2 мл питательной среды для клеточных культур. Ресуспендированный осадок и надосадочную жидкость хранят раздельно при температуре -70 °C и транспортируют в лабораторию на сухом льду в герметично закрытых флаконах, чтобы избежать попадания в них углекислоты.

<*> Если нет в наличии специальной транспортной вирусологической среды, ее можно заменить физиологическим раствором или средой для клеточных культур.

Поскольку вероятность выделения вируса максимальна в первые 3 дня с момента появления сыпи, не следует задерживаться со сбором клинического материала для изоляции вируса; не ожидать результатов лабораторного подтверждения клинического диагноза кори.

2.3. Сбор, транспортировка и хранение крови

Для выделения вируса из лимфоидных клеток кровь берут из вены в строго асептических условиях на 1 - 3 день сыпи в объеме 1,0 - 2,0 мл. Кровь берут в стерильную пробирку с плотно закрытой пробкой. В пробирке должно находиться 0,1 мл гепарина - 500 МЕ (в 1 мл жидкого гепарина - 5000 МЕ). Непосредственно перед взятием крови пробирку с гепарином раскатывают по твердой поверхности для смачивания стенок пробирки гепарином, что предотвращает образование сгустков (пробку не мочить!). Хранить при +4 °C не более 24 часов. Как можно раньше отправить в Национальный центр, соблюдая холодовой режим (+4 °C).

Примечания. 1. Транспортная среда для выделения вирусов:

основной раствор Хенкса pH 7,4 с ХЕПЕС буфером (имеется концентрированный коммерческий раствор 10X);

бычий сывороточный альбумин - 2,0 г;

раствор пенициллина со стрептомицином (см. ниже) - 1,0 мл;

феноловый красный, 0,4%-ный раствор - 0,2 мл.

Растворите 2,0 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл дистиллированной воды, добавьте к 80 мл дистиллированной воды 10 мл раствора Хенкса, затем добавьте 10 мл 2%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина и 0,2 мл раствора фенолового красного. Стерилизуйте фильтрованием. Добавьте 1 мл раствора пенициллина со стрептомицином, разлейте в стерильные флаконы и храните при 4 °C.

2. Раствор пенициллина со стрептомицином:

кристаллический пенициллин С;

стрептомицин сульфат.

Растворите 10 в 6 ЕД пенициллина и 1,0 г стрептомицина в 100 мл стерильного ФБР. Разлейте во флаконы по 5 мл, храните при -20 °C. Добавление 1 мл этого раствора к 100 мл питательной среды позволяет получить раствор с окончательной концентрацией 1200 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина в 1 мл раствора.

3. Доставка вируссодержащих образцов в Национальный центр осуществляется по запросу Национального центра с заполнением части А "Направления в лабораторию центра госсанэпиднадзора с функциями контроля за корью" (Приложение N 2).

Приложение N 5
к Приказу
Министерства здравоохранения
Российской Федерации
от 21 марта 2003 г. N 117