в базе 1 113 607 документа
Последнее обновление: 28.06.2022

Законодательная база Российской Федерации

Расширенный поиск Популярные запросы

8 (800) 350-23-61

Бесплатная горячая линия юридической помощи

Навигация
Федеральное законодательство
Содержание
  • Главная
  • ПРИКАЗ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ"
не действует Редакция от 21.03.2003 Подробная информация
ПРИКАЗ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ"

V. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ КОМПЛЕКСА MYCOBATERIUM TUBERCULOSIS

5.1. Предварительная идентификация комплекса mycobacterium tuberculosis

Первичная идентификация микобактерий комплекса М.tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам:

- скорость роста на плотных питательных средах;

- пигментообразование;

- морфология колоний;

- наличие кислотоустойчивости;

- температура роста.

Таблица 5

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ КОМПЛЕКСА М.TUBERCULOSIS

Культуральные признаки Комплекс М.tuberculosis
Скорость роста Медленнорастущие > 3 недель
Пигментообразование Цвет слоновой кости
Морфология колоний R или S формы
Наличие кислотоустойчивости Выраженная кислотоустойчивая окраска
Температура роста Оптимальный рост при 35 - 37 °C

Несмотря на то, что предварительное заключение о выделении микобактерий туберкулеза может быть сделано опытным бактериологом на основании вышеперечисленных характерных признаков, подтверждение принадлежности выделенной культуры микобактерий к комплексу М.tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов является обязательным.

5.2. Основные биохимические тесты идентификации М.tuberculosis

Ниацин (производное никотиновой кислоты) играет чрезвычайно важную роль в осуществлении всех окислительно-восстановительных реакций, происходящих в клетках кислотоустойчивых микобактерий. Ниацин продуцируют все микобактерии, однако исследования показали, что у М.tuberculosis в результате блокирования ряда метаболических путей никотиновая кислота накапливается в больших количествах, во много раз превышающих ее содержание в клетках микобактерий других видов. Ниацинотрицательные штаммы М.tuberculosis встречаются чрезвычайно редко. В то же время ниациновый тест не должен использоваться как единственный для идентификации М.tuberculosis, так как отдельные штаммы М.bovis, в том числе и субштаммы BCG, а также некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (M.simiae, М.chelonae chemovar niacinogenes) обладают относительно высокой способностью синтезировать ниацин и давать положительную реакцию. Это указывает на необходимость при дифференциации выделенных микобактерий не ограничиваться только ниациновой пробой, а использовать весь рекомендованный выше комплекс реакций.

Принцип метода. Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание. Наибольшее количество никотиновой кислоты обнаруживается у штаммов, выращенных на среде Левенштейна-Йенсена, поэтому именно эта среда используется для проведения ниациновой пробы. Подлежащая дифференциации культура микобактерий должна быть выращена на среде Левенштейна-Йенсена в течение не менее 3 - 4 недель и должна иметь достаточно массивный (не менее 50 колоний) рост.

При отрицательном результате реакции следует повторить ее после 6 или более недель инкубации посева, так как возможно, что молодая культура микобактерий не выделила достаточное для реакции количество никотиновой кислоты.

При постановке ниациновой пробы необходимо иметь в виду, что M.tuberculosis выделяют продуцируемую ими никотиновую кислоту в питательную среду, на которой они выращиваются. В связи с этим при наличии на поверхности косяка с питательной средой сливного роста микобактерий возможен ложноотрицательный результат реакции, так как экстрагирующий ниацин реактив не всегда может проникнуть в глубь питательной среды. Для облегчения проникновения экстрагирующего реактива в питательную среду необходимо при наличии на ее поверхности сливного роста микобактерий либо снять и удалить часть колоний, либо проколоть поверхность культуры.

Реакция требует свободного доступа кислорода на протяжении всего исследования, поэтому следует пользоваться либо ватно-марлевыми пробками, либо специальными металлическими колпачками, обеспечивающими свободный доступ воздуха в пробирку.

Ниациновый тест можно выполнять либо с растворами химических реактивов, приготавливаемыми непосредственно перед постановкой пробы, либо с заранее приготовленными в лабораторных условиях или коммерческими бумажными полосками.

Ниациновый тест с растворами химических реактивов требует соблюдения максимальной осторожности, так как цианистые соединения чрезвычайно токсичны при ингаляции паров и вызывают слезотечение, а анилин обладает онкогенным воздействием и способен проникать через кожный барьер. Пробу следует проводить только в вытяжном шкафу! Эти обстоятельства ограничивают применение ниациновой пробы с растворами химических реактивов.

В большинстве бактериологических лабораторий для постановки ниациновой пробы пользуются специально приготовленными бумажными полосками. Преимущество этого метода заключается в использовании вместо цианистых соединений роданистого калия - вещества более безопасного и доступного для бактериологических лабораторий, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3 - 4 часа получить ответ о принадлежности выделенной на плотной питательной среде культуры к микобактериям человеческого вида или к другим микобактериям.

Следует иметь в виду, что из-за нестабильности растворов и реагентов необходимо строго соблюдать правила хранения и сроки использования как растворов и реагентов, так и бумажных полосок. В сомнительных случаях реагенты и полоски должны сравниваться со свежеприготовленными.

Реактивы для пропитывания бумажных полосок:

Раствор 1. 20% раствор ПАСК (парааминосалициловой кислоты)

В пробирку с 1,75 мл 96° этанола добавляют 0,25 мл диметилсульфоксида и 400 мг ПАСК.

Смесь подогревают на водяной бане при 56 °C в течение 5 - 10 минут при периодическом встряхивании до полного растворения ПАСК.

Раствор 2. 60% раствор роданистого калия

Навеску 1,5 г роданистого калия растворяют в пробирке с 2,5 мл 8% раствора лимонной кислоты (200 мг лимонной кислоты и 2,5 мл дистиллированной воды).

Раствор 3. 50% раствор хлорамина "Б"

3,125 г хлорамина "Б" растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды на водяной бане при температуре 56 - 60 °C при периодическом встряхивании.

Индикаторные бумажные полоски размером 60 x 80 мм готовят из фильтровальной бумаги Filtrak 11 или аналогичной. Один конец полоски отмечают простым карандашом. Оттянутыми пастеровскими пипетками на полоски наносят по 1 капле свежеприготовленных растворов в следующем порядке:

- 20% раствор ПАСК - на отмеченный карандашом конец полоски;

- 60% раствор роданистого калия - на середину полоски;

- 50% горячий раствор хлорамина "Б" - на свободный конец полоски;

- между каплями должны оставаться сухие промежутки.

Индикаторные полоски высушивают в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем для получения более четких результатов наносят повторно 1 каплю хлорамина "Б" на уже высохшую каплю этого раствора. Полоски вновь высушивают, затем помещают в пробирки, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Полоски пригодны к употреблению в течение 3 месяцев.

Процедура исследования:

- добавить в пробирку с исследуемой культурой микобактерий 1 - 1,5 мл стерильной дистиллированной воды. При наличии сливного роста проткнуть поверхность среды в нескольких местах пипеткой для облегчения доступа раствора к питательной среде;

- поместить пробирку в термостат на 2 - 3 часа в полугоризонтальном положении с тем, чтобы жидкость покрывала всю поверхность среды;

- вынуть пробирку из термостата и перевести ее в вертикальное положение, позволив жидкости стечь на дно в течение 5 - 6 минут;

- в чистую стерильную пробирку перенести пипеткой 0,5 - 0,6 мл экстракта;

- индикаторную полоску помеченным карандашом концом, на который нанесена ПАСК, опустить с помощью пинцета в пробирку с экстрактом, не допуская смачивания экстрагирующей жидкостью средней части полоски, на которую был нанесен роданистый калий;

- немедленно закрыть пробирку резиновой пробкой;

- оставить при комнатной температуре на 15 - 30 минут; допустимо осторожно покачивать пробирку, пока вся полоска не пропитается экстрактом;

- наблюдать за окрашиванием жидкости на дне пробирки на белом фоне.

При положительном ниациновом тесте экстракт окрашивается в желтый цвет разной интенсивности. Любая окраска индикаторной полоски не принимается во внимание, так как это может происходить вследствие окисления реактивов в верхней части полоски. Для дегазации пробирок после проведения реакции пользуются 10% раствором нашатырного спирта, 10% раствором едкого натра или любым щелочным дезинфицирующим средством.

5.3. Дополнительные биохимические тесты

В лабораториях, в которых оборудование и/или отсутствие реагентов не позволяют производить постановку ниацинового и нитратредуктазного тестов, для идентификации микобактерий туберкулеза может быть использована комбинация одного или нескольких описанных выше каталазных тестов, а также определение способности к росту при 37 °C на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей паранитробензойную кислоту (PNB-тест).

Приготовление среды с паранитробензойной кислотой

50 мг паранитробензойной кислоты (ПНБ) хорошо растирают в ступке, добавляют 5 мл дистиллированной воды и примерно 20 капель (1,0 мл) 4% едкого натра до pH = 8. После полного растворения ПНБ добавляют 2 - 3 капли 6% соляной кислоты, доводя pH до 7,0. Полученный раствор добавляют к 95 мл предварительно профильтрованной яичной среды, получая таким образом конечную концентрацию паранитробензойной кислоты в среде, равную 500 мкг/мл. Свертывание среды производят в обычном порядке.

Процедура исследования

Перед проведением теста необходимо приготовить пробирки с питательной средой Левенштейна-Йенсена, содержащей паранитробензойную кислоту в концентрации 500 мкг/мл. В качестве контроля используются пробирки со стандартной средой Левенштейна-Йенсена.

Произвести посев в две пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, одна из которых содержит паранитробензойную кислоту в концентрации 500 мкг/л, другая - контрольная без паранитробензойной кислоты.

В процессе инкубации при 37 °C пробирки исследуются на 3-й, 7-й, 14-й и 21-й день.

  • Главная
  • ПРИКАЗ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ"