Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ"

Определение спектра и степени устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам имеет важное значение для тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения, определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического мониторинга лекарственной устойчивости микобактерий в пределах отдельной территории, страны и мирового сообщества. Степень лекарственной устойчивости микобактерий определяется в соответствии с установленными критериями, которые зависят как от противотуберкулезной активности лекарственного препарата, так и его концентрации в очаге поражения, величины максимальной терапевтической дозы, фармакокинетики препарата и многих других факторов.

В настоящее время для определения лекарственной устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам в международной практике используются следующие методы:

- метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена или на среде Миддлбрука 7Н10;

- метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена;

- метод коэффициента резистентности;

- радиометрический метод Bactec R 460.

Выбор того или иного метода определяется традиционно сложившимися методическими подходами, используемыми в данной стране. Однако необходимо иметь в виду, что обязательным условием эффективного мониторинга, обеспечения эпидемиологического надзора за лекарственной устойчивостью микобактерий и распространением лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя, а также сопоставления результатов исследований и эффективности лечения в масштабах страны должен использоваться только один из предложенных унифицированных методов.

В нашей стране получило распространение определение лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена.

При всех методах определения лекарственной устойчивости необходимым звеном в деятельности лаборатории является обеспечение контроля качества исследований.

Чувствительность микобактерий к противотуберкулезным препаратам определяется неспособностью штамма расти на среде, содержащей препарат, при стандартных условиях постановки опыта. Чувствительными к данному препарату считаются те штаммы микобактерий, на которые этот препарат в критической концентрации оказывает бактерицидное или бактериостатическое действие в соответствии с принятым критерием устойчивости.

Устойчивость (резистентность) определяется как снижение чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации.

Наряду с понятиями "чувствительность" и "устойчивость" к противотуберкулезным препаратам в настоящее время используются также термины, определяющие различные аспекты лекарственной устойчивости. Так, в случае наличия лекарственной устойчивости к двум или более лекарственным препаратам данный штамм микобактерий определяется как полирезистентный.

Особое место среди полирезистентных занимают микобактерии, у которых обнаруживается лекарственная устойчивость к двум основным противотуберкулезным препаратам (изониазиду и рифампицину) - штаммы, обладающие лекарственной устойчивостью одновременно к изониазиду и рифампицину, независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, обозначаются как штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (или штаммы с МЛУ).

Этим штаммам уделяется особое внимание, так как лечение пациентов, у которых процесс вызван такими штаммами, представляет большие трудности. Оно является длительным, дорогостоящим и требует использования препаратов резервного ряда, многие из которых дорогостоящие и могут вызывать тяжелые побочные реакции. Кроме того, некоторые штаммы с множественной лекарственной устойчивостью обладают повышенной способностью к распространению (трансмиссивностью) и вызывают тяжелые прогрессирующие формы заболевания, нередко приводящие к неблагоприятным исходам.

Наряду с перечисленными определениями различных видов спектра лекарственной устойчивости микобактерий, в международной практике принято различать первичную и приобретенную лекарственную устойчивость.

Первичная лекарственная устойчивость определяется как устойчивость, обнаруженная у микобактерий, выделенных от пациента, никогда не принимавшего противотуберкулезные препараты или получавшего такое лечение менее одного месяца. В данном случае подразумевается, что больной заразился лекарственно-устойчивым штаммом микобактерий. Первичная лекарственная устойчивость характеризует состояние микобактериальной популяции, циркулирующей в данной территории, и ее показатели важны для оценки степени напряженности эпидемической ситуации.

Приобретенная (вторичная) лекарственная устойчивость определяется как устойчивость микобактерий, выявленных у больного туберкулезом, получавшего лечение противотуберкулезными препаратами в течение месяца и более. Вторичная лекарственная устойчивость является косвенным показателем эффективности проводимой химиотерапии.

Уровень устойчивости данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение микобактерий (по числу колоний на плотных средах).

Лекарственно-устойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное воздействие.

Критические концентрации. Критерии лекарственной устойчивости.

Для различных препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на микобактерии туберкулеза в условиях макроорганизма.

КРИТЕРИЕМ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ НАЗЫВАЮТ ПОКАЗАТЕЛЬ РОСТА МИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО ПУЛА, ВЫРАЖЕННЫЙ В АБСОЛЮТНЫХ (ЧИСЛО КОЕ) ИЛИ ОТНОСИТЕЛЬНЫХ ЕДИНИЦАХ (ПРОПОРЦИЯ КОЕ), НА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ, СОДЕРЖАЩЕЙ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ ПРЕПАРАТ В КРИТИЧЕСКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, ПРЕВЫШЕНИЕ КОТОРОГО СЧИТАЕТСЯ НАЛИЧИЕМ ПРИЗНАКА УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ.

Для метода абсолютных концентраций появление более 20 КОЕ микобактерий на питательной среде, содержащей лекарственный препарат в критической концентрации, свидетельствует о том, что данный штамм микобактерий обладает лекарственной устойчивостью. При этом необходимо иметь в виду, что объем засеваемой суспензии клеток стандартизован и соответствует 1 x 10(7) микробных тел.

Для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же препарата различна. Значения критических концентраций существенно отличаются также при использовании разных методов определения лекарственной чувствительности.

Таблица 8

КРИТИЧЕСКИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕТОДОМ АБСОЛЮТНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ НА СРЕДЕ ЛЕВЕНШТЕЙНА-ЙЕНСЕНА

<*> Критические концентрации препаратов II ряда носят ориентировочный характер и будут окончательно установлены после дополнительных исследований.

В питательную среду Левенштейна-Йенсена, не содержащую крахмала (крахмал адсорбирует лекарственные препараты), непосредственно перед свертыванием добавляют рабочие разведения различных противотуберкулезных препаратов.

Для приготовления питательных сред с целью определения лекарственной устойчивости микобактерий должны использоваться химически чистые субстанции противотуберкулезных препаратов.

ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИЗ ХИМИЧЕСКИ ЧИСТОЙ ПОРОШКОВИДНОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА РАБОЧИХ РАСТВОРОВ, СОДЕРЖАЩИХ НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ, РАСЧЕТЫ ПРОИЗВОДЯТ С УЧЕТОМ ПРОЦЕНТА АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА.

Активность препарата может варьировать от одной его серии к другой серии. Сведения об активности приводятся на этикетках или упаковках лекарственных препаратов и могут быть получены от компании-изготовителя.

Наряду с непрямым определением лекарственной устойчивости микобактерий в ряде случаев при наличии у больного массивного бактериовыделения (значительное или умеренное количество микобактерий - см. таблицу 3), выявляемого при микроскопическом исследовании мазка нативного материала или осадка, можно использовать метод прямого определения лекарственной устойчивости. В таких случаях производится прямой посев осадка обработанного детергентами диагностического материала на набор питательных сред с противотуберкулезными препаратами. Параллельно, чтобы не упустить возможность выделения культуры микобактерий, обязательно производится посев материала на стандартные питательные среды. Метод прямого определения лекарственной устойчивости может (в случае положительного результата) значительно ускорить получение ответа о лекарственной устойчивости возбудителя. Однако следует иметь в виду, что при его выполнении (в отличие от непрямого метода) производится недозированный засев микобактерий, что значительно затрудняет интерпретацию результатов.

6.4.2. Метод пропорций

Метод основан на сравнении числа микобактерий выделенной культуры, выросших в отсутствии препарата и в его присутствии в критических концентрациях. Для этого приготовленную, как описано выше, суспензию микобактерий, содержащую 1 мг/мл влажного веса микобактерий, разводят до концентрации 10(-4) и 10(-6). Оба разведения суспензии засевают на питательную среду без препарата и на набор сред с разными препаратами. Если на среде с препаратом вырастают колонии, составляющие более 1% от числа выросших на среде без препарата, культура считается устойчивой к данному препарату. Если количество КОЕ, устойчивых к данному препарату, менее 1%, культура считается чувствительной.

6.4.3. Метод коэффициента резистентности

Этот метод основан на определении соотношения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), определяемой для данного штамма конкретного больного, к МИК лекарственно-чувствительного стандартного штамма H37Rv, испытываемых в одном и том же эксперименте. В данном случае штамм H37Rv используется не для контроля опыта, а для определения возможных вариаций при постановке теста. С этой точки зрения данный метод является наиболее точным из трех вышеперечисленных, однако в силу необходимости использовать большое количество пробирок с питательной средой он является и наиболее дорогим. Последнее обстоятельство резко ограничивает его применение.

Кроме описанных выше классических методов культивирования микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах, в настоящее время нашли свое применение следующие системы культуральной диагностики микобактерий и определения лекарственной устойчивости.

Полуавтоматизированная радиометрическая система для выявления микобактерий в диагностическом материале и определения лекарственной устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Для роста микобактерий в системе используются флаконы с жидкой питательной средой, которая представляет собой обогащенную бульонную основу, содержащую C(14) - меченый субстрат. По мере роста микобактерий утилизируют меченый субстрат и выделяют радиоактивный углекислый газ C(14)O2 в пространство над средой во флаконе. В процессе тестирования газ автоматически забирается из флакона, уровень радиоактивности измеряется и регистрируется в виде индекса роста по шкале от 0 до 999. Результат посева считается положительным, если индекс роста превышает заданный порог. Ежедневное изменение индекса роста пропорционально степени роста микобактерий туберкулеза в среде. Наличие роста микобактерий может быть зафиксировано начиная с 4 - 5 суток от момента посева, учет результатов производят в течение 6 недель.

Для выделения микобактерий и определения лекарственной устойчивости может быть использована система с индикацией роста по флюоресценции в ультрафиолетовом свете. Пробирки с индикатором роста содержат модифицированный бульон. В пробирки с питательной средой вносят обогатитель и смесь антибиотиков, подавляющую рост посторонней микрофлоры. Встроенный в силикон дна пробирок флюоресцентный компонент чувствителен к присутствию кислорода, растворенного в бульоне. Высокие начальные концентрации растворенного кислорода гасят эмиссию этого вещества, и регистрируется очень низкий уровень флюоресценции. Позднее активно размножающиеся микобактерии поглощают кислород, что позволяет наблюдать более интенсивную флюоресценцию при использовании ультрафиолетового трансиллюминатора. Рост также может быть зафиксирован по наличию негомогенной замутненности - мелких зерен или хлопьев в культуральной среде. Учет результатов производится в течение 8-ми недель от момента посева. Для определения лекарственной устойчивости требуется от 3-х до 14-ти дней.

ВО ВСЕХ СЛУЧАЯХ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ АНАЛИЗА ДОЛЖЕН ОБЯЗАТЕЛЬНО ПОДТВЕРЖДАТЬСЯ ПРИ КОНТРОЛЬНОМ МИКРОСКОПИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ НА НАЛИЧИЕ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ БАКТЕРИЙ И ОТСУТСТВИЕ РОСТА ЗАГРЯЗНЯЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ.

Метод, основанный на технологии колориметрического детектирования продукции CO2 как продукта метаболизма субстратов среды развивающимися в ней микроорганизмами. Он обеспечивает уровень чувствительности, ранее достижимый только с помощью радиометрических методик, при высоком уровне безопасности, сокращении времени анализа и трудозатрат.

Система включает флаконы с питательной средой и реагенты, детекторно-инкубационные модули и компьютерную систему учета. В системе используется питательная среда с добавками факторов роста. Система совмещает 3 функции: выделение микроорганизмов из крови; выделение микобактерий из различного диагностического материала; проверка стерильности.

Последняя разработка, используемая для определения лекарственной чувствительности микобактерий к критическим концентрациям 5 противотуберкулезных препаратов (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол и пиразинамид), основана на сочетании агарового метода пропорций с радиометрическими методами, использующими жидкие питательные среды.

Приложение N 12
к Приказу Минздрава России
от 21 марта 2003 г. N 109