Законодательная база Российской Федерации

"МЕТОДЫ САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.796-99" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22.12.99)

Наибольшее количество личинок стронгилят обнаруживают в прикорневой части травы, в 3 - 5 см от почвы. Для выявления личинок нематод применяют метод Бермана. Собранную на пастбище траву (0,5 - 1 кг на пробу) перед закладкой в аппарат Бермана ножницами разрезают на части (для исследования используют нижнюю часть растений). Аппарат с травой и теплой водой оставляют на 1 - 2 часа. Затем пробирки с осадком центрифугируют 1 - 2 минуты при 800 об./мин., надосадочный слой жидкости сливают, а осадок микроскопируют на предметном стекле.

Сено, взятое из стога, исследуют аналогично.

Метод позволяет исследовать пробы трав большой массы, что увеличивает вероятность выявления личинок стронгилят.

Оборудование: сита диаметром 31 см, высотой боковой стенки 12 см (сетка из нержавеющей проволоки, размер ячеек 1 мм), сетку укрепляют на уровне 2 см от нижнего края сита, тазы диаметром 36 см (по верхнему краю), высотой 15 см, книзу таз постепенно сужается. При внесении в таз сита нижний край последнего упирается в сужение таза. Между сеткой сита и дном таза создается пространство высотой 5 см, стеклянные воронки диаметром 18 - 20 см (по верхнему краю) с резиновыми трубками и пробирками на концах, штатив для воронок, пробирки, пипетки (глазные), раствор Люголя для фиксации личинок, предметные стекла, цилиндры, микроскоп.

Ход исследования. В тазы ставят сита и заполняют водой комнатной температуры. Уровень воды не должен доходить до верхнего края таза на 1 - 1,5 см. Образовавшиеся под сеткой пузырьки воздуха удаляют резким движением сита вверх-вниз. В каждое сито с водой вносят 100 - 120 г травы. Продолжительность выделения личинок - сутки. Для сбора личинок, осевших на дно таза, осторожно удаляют сита с травой. Через 15 - 20 минут после удаления сита надосадочную жидкость сливают, оставляя на дне таза около 1 - 1,5 л. Жидкость перемешивают и вместе с осадком переливают в воронки с пробирками на концах. Отстаивание личинок в воронках продолжается 1 - 2 часа. Остальной ход исследования проводят обычным способом. Личинки подсчитывают при малом увеличении микроскопа. В каплю воды с личинками для обезвоживания последних вносят одну каплю раствора Люголя. При обилии личинок в осадке для их подсчета применяют способ разведений.

Пробы трав собирают в биотопах моллюсков. Для отбора проб водных растений с адолескариями желательно пользоваться лупой. Адолескарий можно заметить даже невооруженным глазом на листьях и стеблях растений. Их обнаруживают преимущественно на нижней и реже верхней поверхности листьев, черешках листьев и стеблях растений. Они встречаются одиночно и группами. В лаборатории с помощью иглы и скальпеля освобождают адолескарии и изучают на предметном стекле в капле физиологического раствора.

Адолескария фасциолы внешне представляет округлое образование диаметром около 0,3 мм, прикрепившееся к растению, покрытое двумя оболочками. Если адолескария живая, то внутри цисты личинка может свободно двигаться. Это чаще наблюдается, если адолескарию поместить в каплю теплой воды (37 - 38 °С). При микроскопировании видны почти одинаковые по размеру ротовая и брюшная присоски, глотка, два кишечных ствола, продолжающиеся до конца тела и экскреторный пузырь. Молодые адолескарии молочно-белого цвета, позднее они желтеют, а затем темнеют до буро-коричневого цвета. Адолескарии фасциолы гигантской по форме и размеру не отличаются от обыкновенной (рис. 1 - не приводится).

Адолескарии парамфистомат сходны с таковыми фасциол, замечаются в виде блестящих черных или коричневых точек. Тело полусферической формы, снаружи покрыто слоистой светлой оболочкой, диаметр 0,23 - 0,26 мм. Внутри цисты - подвижная личинка с теми же органами (глазки, фаринкс, брюшная присоска, экскреторные сосуды и пузырь), что и у церкария. При этом брюшная присоска очень крупная, ротовая, наоборот, рудиментарная или слабо развита.

Для сбора адолескарий фасциолы используют стекла размером 18 х 13 см, толщиной 1,5 мм (можно куски плексиглаза размером 16 х 7 см, толщиной 1,2 мм), которые ставят вертикально, закрепляют нижнюю часть на 2 - 3 см в грунт водоема и оставляют на 7 суток. Затем их проверяют и при необходимости заменяют другими. Церкарии, встречая на своем пути стекла, прикрепляются к ним и инцистируются, превращаясь в адолескарий. Стекла просматривают невооруженным глазом. При наличии белых точек (возможно адолескарии) их исследуют под лупой. Стекла ставят в мочажины, временные водоемы, где обитают малые прудовики. Плоскости стекол должны быть обращены с востока на запад.

Для сбора пыли используют камеру, представляющую металлический цилиндр длиной 110 - 120 мм с внутренним диаметром 27 мм (по ширине стандартного предметного стекла). В стенке цилиндра имеется всасывающее отверстие размером 2 х 25 мм. Внутри цилиндра укреплены 2 стержня, фиксирующие предметное стекло в диаметральной плоскости и продольном направлении. С одного конца цилиндр закрывают съемной крышкой, а открытым концом присоединяют к патрубку пылесоса или другого всасывающего устройства (аспиратор, воздуходувка и т.п.).

На одну сторону чистого предметного стекла наносят тонкий слой 50%-ного раствора глицерина в виде полоски 1,5 - 2 см и длиной 4 - 5 см. Стекло вставляют в камеру так, чтобы смазанная глицерином поверхность была обращена к всасывающему отверстию камеры. Камеру закрывают крышкой. Затем включают пылесос или другое всасывающее устройство и производят отбор пыли.

При отборе проб всасывающее отверстие камеры должно быть обращено к исследуемой поверхности на расстоянии 2 - 3 мм и равномерно перемещаться над ней. На одну пробу собирают пыль с площади до 0,25 кв. м в течение 15 - 20 сек., воздуха - 60 сек. После отбора пробы пылесос или другое всасывающее устройство выключают, открывают камеру и извлекают предметное стекло. На смазанной стороне стекла будет отчетливо виден пылевой след, представляющий собой готовый препарат, который микроскопируют (при увеличении х56 - 80). Если препарат получился плотным, его просветляют 1 - 2 каплями воды или 50%-ного раствора глицерина. Под микроскопом среди пылевых частиц хорошо видны яйца гельминтов. Микроскопирование препаратов может производиться на обследуемом объекте сразу после отбора проб или в лаборатории.

Сбор проб пыли и воздуха непосредственно на предметное стекло, покрытое клейкой смазкой, исключает использование фильтров, центрифугирование, приготовление мазков, во время которого могут быть потери яиц гельминтов или нарушение их целостности. Кроме того, использование клейких стекол ускоряет время отбора проб и позволяет, что особенно важно при обследовании детских учреждений, просматривать предметные стекла на местах обследования. Последнее дает возможность на местах составлять план мероприятий по предупреждению загрязнения и дегельминтизации внешней среды.

Для отбора и исследования проб пыли можно применять липкую целлофановую ленту со слоем клея до 3 мм. Ленту приклеивают к различным предметам обихода, а затем исследуют ее под микроскопом, добавив несколько капель касторового масла. Ленты шириной 20 мм и длиной 7 - 8 см следует приклеивать липким слоем к разным участкам исследуемой поверхности 6 - 8 раз в зависимости от запыленности объекта, а затем ее помещают на предметное стекло. Препарат может храниться несколько дней. В лаборатории ленту отклеивают на большом протяжении и вносят под нее несколько капель касторового или вазелинового масла (для устранения пузырьков воздуха) и исследуют при малом увеличении микроскопа. Липкой лентой нельзя делать отбор проб пыли с бумажных поверхностей (книги), волосяных игрушек и очень загрязненных предметов (половики, коврики).

Основными условиями методической работы должны быть: последовательность проведения опытов и их серий, выбор оптимальной концентрации химических веществ и экспозиции, оптимальная среда для испытуемого средства, правильное определение жизнеспособности яиц.

Лабораторные опыты проводят в двух сериях. В первой - определяют степень воздействия изучаемых химических веществ на яйца гельминтов на стадии дробления и стадии инвазионной личинки. Устанавливают концентрацию препаратов, экспозицию и стадию развития яиц.

Взвесь яиц гельминтов помещают в чашки Петри (по 600 - 800 в каждой) или бюксы. Начинают испытание препарата при 3%-ном разведении и экспозиции 30 мин. После этого яйца гельминтов отмывают водой вручную не менее 5, а с помощью центрифуги - не менее 2 раз. В контроле яйца гельминтов находятся в воде. Затем взвесь яиц гельминтов центрифугируют и выдерживают в термостате, меняя воду через каждые 2 - 3 суток. Жизнеспособность яиц (не менее 300) определяют через 15 - 20 суток общепринятыми методами. При выявлении эффективных овицидов исследования с ними повторяют, но уже в меньших концентрациях и, соответственно, экспозициях.

Во второй серии, испытывают выявленные эффективные препараты на яйца гельминтов в фекалиях. Испытывают только те препараты, которые проявили сильное или выраженное овицидное действие в первой серии. На дощечку (дерево, цемент) размером 10 х 15 см наносят 0,5 г фекалий, обсемененных яйцами гельминтов (5 яиц на 1 куб. см). Рабочие растворы или эмульсии испытуемых веществ наносят на дощечки с помощью пульверизатора из расчета 1 л/кв. м. Контрольные дощечки поливают водой. Исследования наиболее часто проводят при экспозиции от 30 до 180 мин. Затем фекалии собирают, промывают водой, выделяют яйца гельминтов и культивируют их в термостате. После определения их жизнеспособности устанавливают эффективность испытуемого средства.

Перед тем, как перейти к дальнейшей апробации выявленных овицидов, определяют их токсичность и коррозионную активность.

Испытуемые соединения оценивают по степени их овицидного действия по следующей схеме. В 1 серии опытов проводят отбор химических веществ, обладающих сильными, выраженными и слабыми овицидными свойствами, т.е. с высокой, средней и слабой эффективностью. К первым относятся соединения, которые в наиболее приемлемых концентрациях вызывают гибель всех яиц гельминтов; ко вторым - соединения, убивающие свыше 50% яиц; к третьим - соединения, вызывающие гибель менее 50% яиц гельминтов. Критерий экспозиции предусматривается в пределах 30 минут. Во 2 серии опытов экспозиция увеличивается до 60 минут.

В производственных условиях оценку препаратов проводят по результатам дезинвазии помещений. Дезинвазию оценивают высокоэффективной в том случае, если овицидный эффект (ОЭ) достигает 90 - 100%, удовлетворительной, если ОЭ равен 60 - 90%, неудовлетворительной, если ОЭ менее 60%. В данной оценке за основные критерии принимают допустимые концентрации препарата и экспозицию в пределах 3 часов.

Лабораторные опыты проводят в нескольких сериях. В первой серии используют деревянные ящики шириной 20 см, длиной 45 - 60 см, глубиной 20 - 30 см. Дно и стенки ящиков имеют отверстия, а внутри они разделены на секции, предназначенные для разных экспозиций испытуемых препаратов. В контроле используют отдельный ящик. Почву (разных видов) помещают в ящики послойно (15, 10, 5, 1 см), закладывают пробы яиц на стадии дробления и отдельно на стадии инвазионной личинки (в каждой пробе не менее 1000 яиц). Взвесь яиц гельминтов вносят на полоски фильтровальной бумаги и вокруг нее в почву, огражденную проволочным каркасом. Через 1 - 3 суток на опытные участки вносят рабочий раствор препарата, а на контрольные - воду. Первоначально испытывают 3%-ный раствор препарата при норме расхода 4 л/кв. м и экспозиции 1, 3, 5 суток. Затем эти пробы извлекают, отмывают от препарата (не менее 5 раз). Выделенные из проб яйца гельминтов культивируют в термостате (24 - 26 °С). Жизнеспособность их определяют через 15 - 20 суток общепринятыми методами. По результатам этих исследований оценивают овицидную эффективность препарата. Опыт повторяют, используя раствор другой концентрации и экспозиции.

Следующую серию опытов осуществляют с активными овицидами по такой же методике, но в почву при этом закладывают пробы фекалий, обсемененные яйцами гельминтов (извлеченные из концевых отделов маток гельминтов или полученные из фекалий зараженных животных). У наиболее перспективных овицидов определяют токсические и коррозионные свойства.

Полевые и полупроизводственные опыты проводят в условиях, исключающих доступ животных и людей. Составляют схему опытов. В первой серии исследования проводят на рыхлой почве, во второй - на твердой. В третьей - на рыхлой и твердой, но после внесения препарата поверхность объекта покрывают пленкой. Во всех сериях опытов участок делят на секции в зависимости от экспозиции. Последующую работу проводят так же, как в лабораторных условиях.

Производственные опыты осуществляют в микроочагах гельминтозов.

Составляют план-схему, в которой предусматривают место и количество обрабатываемой площади, концентрацию и норму расхода рабочего раствора препарата, экспозицию, количество проб почвы, которое необходимо взять до и после обработки объекта. Пробы берут с поверхности и глубины 5, 10 и 15 см (по 4 пробы в каждом случае). Каждую пробу берут на площади не менее 20 х 30 см (масса примерно 80 - 100 г). Эти пробы служат контролем.

Для получения более объективных данных об эффективности препарата на опытных и контрольных участках необходимо производить искусственную закладку проб с яйцами гельминтов. По данным жизнеспособности яиц определяют овицидную эффективность препарата и оценивают качество проведенной дезинвазии.

Определение овицидной эффективности различных средств

В основу метода положен принцип определения экстенсэффективности антигельминтиков и соотношение живых яиц в опыте и контроле. Приводим формулу расчета по Симонову А.П.:

где:

ОЭ - овицидная эффективность препарата (%);

а1 - количество живых яиц гельминтов в опыте;

а2 - в контроле;

с1 - количество яиц, взятых для определения их жизнеспособности, в опыте;

с2 - в контроле;

Р1 - процент погибших яиц в опыте;

Р2 - процент живых яиц в опыте;

n - количество яиц, взятых для определения их жизнеспособности в опыте.

Этот метод может быть использован для определения ларвоцидной эффективности испытуемых средств.

Оценку степени эффективности овицидных средств в почве проводят так же, как и препаратов, испытываемых на твердых поверхностях. Различия обусловлены особенностями объекта обеззараживания и свойствами испытуемого средства. Препарат оценивается по его способности вызывать гибель зародышей гельминтов в различных слоях почвы. С этим же связано и увеличение экспозиции.

Необходимые для исследования концентрации водных растворов испытуемых веществ готовят по методу серийных разведений в серологических пробирках. К 1 мл каждого разведения добавляют по 0,1 мл обогащенной взвеси цист соответствующего вида кишечных простейших. О минимальной протистоцидной дозе испытуемого вещества судят по концентрации водного раствора, вызывающей гибель 100% цист в течение 1 - 2 часов.

Наблюдение за сроками выживаемости цист кишечных простейших в водных растворах испытуемых веществ осуществляют в течение 30 суток. В первые сутки осадок микроскопируют ежечасно, а затем 1 раз в сутки. Жизнеспособность цист простейших после приготовления из них препаратов определяют через различные промежутки времени при помощи люминесцентной микроскопии. В качестве люминофора применяют водный раствор акридинового оранжевого в разведении 1:500 - 1:1000. В препаратах, подвергшихся воздействию химических веществ, окрашенных водным раствором акридинового оранжевого, у жизнеспособных цист кишечных простейших оболочка слегка окрашивается в оранжевый цвет, цитоплазма остается неокрашенной и имеет темноватый оттенок. У погибших цист цитоплазма и оболочка имеют красный цвет. У дегенерирующих цист цитоплазма темно-салатного цвета, ядра ярко-салатные, четко выделяющиеся на фоне цитоплазмы.

Результаты изучения протистоцидной активности химических и других соединений используют при определении эпидемической значимости того или иного фактора передачи и разработке способов обезвреживания от цист патогенных кишечных простейших различных объектов окружающей среды, что является одним из эффективных мероприятий по профилактике вызываемых ими инвазий.

При изучении сроков развития и выживаемости яиц гельминтов требуется проведение специальных экспериментов с искусственной закладкой проб на различных объектах окружающей среды. Опыты необходимо проводить, с одной стороны, в условиях наиболее приближающихся к естественным, а с другой, при которых пробы с яйцами гельминтов сохранялись бы в окружающей среде и их легко было бы извлекать для исследования в любые сроки.

Почва. На поверхности почвы закладку яиц гельминтов проводят одним из следующих способов:

а) на предварительный фильтр наносят не менее 1000 яиц гельминтов и покрывают его другим таким же фильтром, края которых загибают конвертами, после чего их укладывают на полосы плотного мельничного газа и прошивают. Расстояние между соседними фильтрами должно быть не менее 10 см, чтобы при извлечении конца ленты и забора для исследования 1 - 2 фильтров не нарушать другие; мельничный газ с пробами укладывают на поверхность опытного участка, а затем отбирают пробы для исследования;

б) на поверхности участка в почву на глубину 2 - 3 см вдавливают кювет из металлической сетки так, чтобы края его были на 2 - 3 мм выше ее поверхности. Кювет засыпают исследуемой почвой и обсеменяют яйцами гельминтов (из расчета не менее 1000 на 1 кв. см). И в том, и в другом случае пробы для исследования отбирают: весной и осенью 1 раз в 10 суток, летом через каждые 3 - 5 суток, зимой 1 раз в месяц.

При изучении сроков выживаемости яиц гельминтов в почве на разных глубинах (5, 10, 20, 40, 60 см) закладку их целесообразно проводить в специальных пробах.

В опытах применяют яйца тех видов гельминтов, которые представляют наибольшую эпидемиологическую опасность в данной местности. Если нужно установить максимальные сроки выживаемости яиц гельминтов, целесообразно ставить опыты с яйцами аскарид. При этом могут быть использованы как яйца A. lumbricoides, так и A. suum, полученные из рогов матки аскариды, прилегающих к вагине не далее 1 - 1,5 см, а также из фекалий с высокой интенсивностью инвазии (не менее 2 - 3 яиц гельминтов в поле зрения).

Получение чистой взвеси яиц аскарид: порцию фекалий (объемом в столовую ложку) помещают в центрифужную пробирку объемом 150 - 250 мл (лучше в пробирку объемом 250 мл) и заливают водопроводной водой (30 - 120 мл), после чего смесь тщательно размешивают палочкой до образования гомогенной массы и центрифугируют в течение 2 - 3 минут при скорости 800 об./мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют такую же порцию чистой воды; смесь снова размешивают и центрифугируют.

Промывание повторяют не менее 2 - 3 раз. Затем к осадку добавляют насыщенный раствор натрия хлорида (плотность 1,2), смесь размешивают, всплывшие крупные частицы снимают, а смесь центрифугируют 2 - 3 минуты и петлей с поверхности раствора снимают пленку. Эти операции повторяют до тех пор, пока в контрольной капле, взятой на предметное стекло, будут попадаться лишь единичные яйца гельминтов. Затем начинают второй этап - выделение яиц гельминтов из слабого раствора соли.

Содержимое сосудов отстаивают в течение 2 - 3 часов, после чего надосадочную жидкость сливают, а осадок фильтруют через 4 - 5 слоев марли или мелкоячеистую сетку на часовые стекла диаметром 10 - 15 см. Легкими круговыми движениями производят закручивание осадка к центру часового стекла, а оставшуюся по периферии жидкость отсасывают пастеровской пипеткой с резиновой грушей. На часовые стекла добавляют небольшое количество воды, смесь снова размешивают и закручивают к центру стекла: такую операцию повторяют до тех пор, пока на стекле не будет чистая взвесь яиц гельминтов. Наблюдение за чистотой взвеси яиц гельминтов проводят под микроскопом. Полученную чистую взвесь переносят в стеклянные бюксы с крышкой, этикетируют и помещают на хранение в холодильник.

Приготовление тест-объектов. Для приготовления тест-объектов используют алюминиевые или пластмассовые бигуди, применяемые для завивки волос. Такой каркас удобен тем, что со всех сторон доступен для почвенного воздуха, влаги, почвы; кроме того, он может долго пролежать в земле, а при выкапывании предохраняет пробу почвы от разрушения. Каркас взвешивают, заполняют исследуемой почвой и снова взвешивают, по разности полученных показателей определяют массу почвы.

Через отверстия в бигуди в почве делают несколько углублений (в разных местах), в которые вносят с помощью пипеток необходимое количество капель раствора с взвесью яиц гельминтов так, чтобы на 1 г почвы их приходилось не менее 1000. Среднее количество яиц гельминтов в одной капле определяют следующим образом: на предметное стекло наносят 5 - 10 капель хорошо перемешанной взвеси. Под микроскопом подсчитывают их количество в каждой капле, суммируют и делят на число капель.

Необходимое для внесения в тест-объект количество капель взвеси определяют по формуле:

где:

n - число капель суспензии из яиц гельминтов;

Р0 - масса упаковки-контейнера без почвы;

Р1 - масса упаковки с почвой;

к - среднее число яиц гельминтов в 1 капле;

1000 - содержание яиц гельминтов в 1 г почвы после обсеменения.

После внесения взвеси яиц гельминтов углубления в каркасе заполняют почвой. Тест-объект заворачивают в мельничный газ, после чего к нему прикрепляют проволоку длиной на 5 - 10 см больше глубины закладки их в почву. После помещения тест-объектов в почву на концах проволоки, выведенных наружу, устанавливают опознавательные знаки. Лучше всего пробы (тест-объекты) готовить в лаборатории и хранить до постановки опыта в холодильнике.

Для закладки тест-объектов на выбранных участках выкапывают ямы шириной 1 - 1,2 м. Длину их рассчитывают в каждом конкретном случае отдельно (в зависимости от количества испытуемых проб). На дно ям укладывают пробы (тест-объекты) на расстоянии 20 - 30 см друг от друга; ямы засыпают сначала той почвой, которая выбрасывалась последней при копке ям; на поверхности полученных грядок устанавливают опознавательные знаки.

Количество тест-объектов должно быть рассчитано на длительный период наблюдения (7 - 10 лет), выемку их для исследования производят в зависимости от климата, характера почв и глубины закладки - не реже 1 раза в месяц при исследовании тест-объектов с глубины до 20 см и не реже 1 раза в квартал при более глубоких закладках. Учитывая, что тест-объекты для исследования можно забирать (для средней полосы России) только с апреля по октябрь, т.е. в течение 7 месяцев, легко подсчитать число тест-объектов, необходимых для закладки на ту или иную глубину (на глубину 5, 10, 20 см в среднем 49 - 70 штук; на глубину 40 и 60 см - 21 - 30 штук).

По опознавательным знакам определяют места нахождения тест-объектов, выкапывают ямы размером 30 х 30 см так, чтобы между стенкой ямы и ближайшим тест-объектом был оставлен слой почвы не менее 10 см. Изъятые из почвы тест-объекты помещают в пакеты из бумаги или целлофана и доставляют в лабораторию для исследования. При определении стадии развития или признаков деформации в каждом опыте необходимо просматривать не менее 100 - 200 яиц гельминтов.

Для изучения сроков развития и выживаемости личинок анкилостомид и стронгилоидов в почве рекомендуется следующая методика: фекалии, содержащие яйца анкилостомид, смешивают с почвой в пластмассовых кюветах (на дне которых просверлены отверстия); последние помещают в почву экспериментальных участков на 7 - 10 дней и ведут ежедневно отбор проб обсемененной почвы для исследования по методу Бермана. Поиск проводят до тех пор, пока вылупившиеся из яиц личинки не достигнут инвазионной стадии, а затем погибнут.

Вода. Для изучения сроков выживаемости яиц гельминтов в воде несколько капель насыщенной взвеси их (не менее 1000) наносят пипеткой на предварительные планктонные фильтры, сложенные воронками. Для устойчивости воронки помещают в штатив из небольшой картонной крышки, в которой сделаны ячейки. После внесения яиц края воронок загибают и вместе с этикетками, указывающими даты и номера опытов, помещают по 2 - 3 экземпляра в стеклянные трубки. Наиболее удобными являются трубки длиной около 7 см, диаметром 2 см с небольшими раструбами, за которые с обеих сторон закрепляют сатин при завязывании отверстий трубок.

В металлическую сетку заворачивают по 3 - 4 трубки и на капроновом шнуре опускают в воду. Если пробы намечено поставить в местах с быстрым течением воды, для удержания проб на необходимой глубине к сетке подвешивают дополнительный груз. Серия из 3 - 4 трубок, связанных вместе, составляет 1 опыт. Часть трубок подвешивают у дна, остальные на различном расстоянии от него. Для просмотра берут по 1 трубке из каждого опыта. Подсчитывают не менее 200 яиц, смытых с фильтра на предметное стекло.

Овощи. Яйца гельминтов (не менее 1000) наносят непосредственно на овощи. Сроки их нахождения на овощах определяют временем роста последних. Опытные овощи помечают, а через нужное время забирают на исследование. Яйца гельминтов очищают скальпелем с поверхности овощей на фильтр и помещают во влажную камеру для развития их в оптимальных лабораторных условиях.

Наблюдения показали, что яйца гельминтов на овощах, не защищенных листьями, смываются дождем. Поэтому взвесь яиц гельминтов целесообразно помещать на фильтрах, которые с помощью ниток крепко фиксируют на поверхности овощей. Для исследования берут не менее 3 фильтров, в каждом из них просматривают не менее 200 - 300 яиц гельминтов, определяя их стадию развития или признаки деформации.

Почва. Для проведения экспериментальных исследований по изучению сроков выживаемости цист патогенных кишечных простейших следует использовать цисты лямблий. Они, при наличии одинаковых микроклиматических условий в окружающей среде, не отличаются по своей устойчивости от таковой цист дизентерийных амеб. Цисты лямблий выделяют из фекалий больных людей методом механического обогащения.

Для проведения опытов из взвеси цист лямблий готовят специальные тест-объекты: на мембранные фильтры N 4 или N 6 наносят 0,2 мл взвеси, содержащей не менее 4 - 5 тысяч жизнеспособных цист. Фильтры складывают по типу конверта и помещают в капроновые мешочки размером 3 х 2,5 см, которые вкладывают в среднюю, нижнюю и верхнюю части перфорированных алюминиевых трубок длиной 10 см, диаметром 2 х 2,5 см, содержащих почву с подопытных участков. Трубки с пробами цист кишечных простейших размещают на расстоянии 8 - 10 см друг от друга в алюминиевой сетке сечением 30 х 50 см и высотой 7 - 10 см, которая предварительно заполняется почвой с подопытного участка. Сетку закапывают в почву на такую глубину, чтобы верхний конец алюминиевых трубок находился на уровне поверхности почвы. Сетку засыпают сверху тонким слоем почвы подопытного участка.

Трубки с пробами цист кишечных простейших вынимают из почвы и доставляют в лабораторию для исследования 1 раз в неделю. Извлеченные из трубок капроновые мешочки ополаскивают чистой водой. Жизнеспособные и погибшие цисты кишечных простейших, содержащиеся на мембранных фильтрах, могут быть идентифицированы под люминесцентным микроскопом при помощи акридинового оранжевого. На предметное стекло наносят каплю 0,1 - 0,2%-ного водного раствора акридинового оранжевого и делают отпечаток с развернутого фильтра, извлеченного из капронового мешочка. Тщательно смывают красителем с фильтра взвесь цист. Полученную на предметном стекле смесь накрывают покровным стеклом и спустя 30 - 45 минут исследуют под люминесцентным микроскопом.

У живых цист наблюдается лишь слегка окрашенная в оранжевый цвет оболочка, а цитоплазма имеет темноватый оттенок. Цитоплазма и оболочка у погибших цист окрашивается в красный или красно-кирпичный цвет.

При отсутствии в лаборатории люминесцентного микроскопа идентификацию жизнеспособных и нежизнеспособных цист кишечных простейших осуществляют под световым микроскопом в препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым. Препараты готовят в этом случае по той же методике, что и при люминесцентной микроскопии. Под световым микроскопом жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают желтую окраску.

Для определения соотношения между жизнеспособными и нежизнеспособными цистами достаточно подсчитать их число в 3 - 5 рядах покровного стекла. Число жизнеспособных и погибших цист, содержащихся в исследуемой пробе, определяют по формуле:

Х = А х В х С х Д,

где:

Х - число живых или погибших цист соответствующего вида кишечных простейших, содержащихся в пробе;

А - число цист, обнаруженных в 1 ряду под покровным стеклом;

В - число рядов покровного стекла, которое было использовано для подсчета цист;

С - число капель в 1 мл смыва;

Д - объем смыва с мембранного фильтра (мл).

О динамике отмирания цист судят по изменению количественного соотношения между жизнеспособными и погибшими цистами.

Сточные воды. Первый этап приготовления тест-объектов в мембранных фильтрах, вложенных в капроновые мешочки, остается таким же, как и при определении сроков выживаемости цист кишечных простейших в почве. Затем мешочки перевязывают сверху нитками и погружают в пробирки высотой 10 - 15 см, диаметром 2 см. В пробирки наливают изотонический раствор натрия хлорида для предупреждения гибели цист до момента погружения пробирок в сточную воду. Для того, чтобы предупредить всплывание в пробирке мешочков с пакетиками исследуемого материала, в них вкладывают кусочки гранита величиной с фасоль. Пробирки с исследуемым материалом помещают в перфорированные жестяные банки, к которым прикрепляется тонкая медная проволока. Перед погружением банок в исследуемую сточную воду изотонический раствор натрия хлорида из пробирок удаляют. Банки с пробками фиксируют при помощи проволоки в условиях опытной канализационной установки. Пробы для исследования извлекают 1 раз в неделю и обрабатывают по той же методике, что и почву.

Поверхность твердых материалов. Обогащенную взвесь цист кишечных простейших объемом 0,2 мл наносят тонким слоем на поверхность опытных образцов, которые помещают в емкости, позволяющие активно регулировать температуру и относительную влажность воздуха. В качестве таких емкостей можно использовать термостат и холодильник, необходимая температура в которых устанавливается при помощи терморегуляторов. Обеспечение необходимой влажности воздуха достигается путем помещения в указанные емкости соответствующего количества чашек Петри с дистиллированной водой, в которой увлажняются полоски из марли. Выживаемость цист целесообразно изучать при температуре 2 - 6 °С и 18 - 27 °С, относительной влажности воздуха 40 - 65% и 80 - 100%. Определение температуры и относительной влажности воздуха производят при помощи термовлагобарометра БМ-2.

Жизнеспособность цист определяют при помощи методов витального окрашивания и люминесцентной микроскопии.

Для того, чтобы установить предельные сроки выживаемости и интенсивность гибели цист кишечных простейших на поверхности опытных образцов, изготовленных из стекла, на изучаемую взвесь цист наносят через определенные промежутки времени каплю 0,1%-ного водного раствора эозина или 1 каплю 0,1 - 0,2%-ного водного раствора акридинового оранжевого, тщательно растирают в ней исследуемую взвесь, покрывают покровным стеклом и просматривают приготовленные препараты соответственно при помощи светового или люминесцентного микроскопа. При изучении выживаемости цист кишечных простейших на опытных образцах, изготовленных из светонепроницаемых материалов (металлы, дерево, полимеры, картон и др.), исследуемую взвесь цист вначале тщательно смешивают на поверхности опытного образца с водным раствором соответствующего красителя, затем каплю этой взвеси переносят на предметное стекло, покрывают ее покровным стеклом и анализируют под световым или люминесцентным микроскопом. В препаратах, окрашенных раствором эозина, жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают розовую окраску. Характер окраски живых и погибших цист при применении акридинового оранжевого под световым и люминесцентным микроскопом такой же, как и при определении их жизнеспособности в почве.

Жизнеспособность яиц гельминтов определяют по внешнему виду, путем окрашивания витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы.

Яйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по мере их гибели она распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли, так называемые "нитки жемчуга".

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от их места нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина - 0,5 г, натрия бикарбоната - 0,09 г, дистиллированной воды - 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36 - 38 °С на 4 часа. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6 - 8 часов в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1%-ный раствор натрия сульфида или 20%-ный раствор натрия гипохлорида, или же в 1%-ный раствор хлорной воды при 36 - 38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 суток. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем "растворяются" в течение 10 минут - 2 часов. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1%-ного раствора натрия хлорида, 0,5%-ного раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36 - 38 °С.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня наиболее проста методика Иониной Н.С.: у живых яиц медианная пара эмбриональных крючьев или параллельна латеральным, или последние образуют с медианной угол у основания меньше 45°. У мертвых яиц латеральные пары образуют у основания угол с медианной парой больше 45° или же крючья беспорядочно разбросаны (утрачивается их парное расположение); иногда наблюдается сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5 - 10° до 38 - 40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых яиц нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3%-ный раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24 - 30 °С, яйца власоглавов в 3%-ном растворе соляной кислоты при температуре 30 - 35 °С; яйца остриц в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 37 °С. Чашки Петри следует открывать 1 - 2 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2 - 3 месяцев свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых дней развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, наливают осторожно на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1 - 2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25 - 30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5 - 7 суток они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооруженным глазом.

Яйца трематод, естественно развивающиеся в воде, например описторхисов, дифиллоботриид, фасциол и других, помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они развиваются быстрее в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22 - 24 °С через 9 - 12 суток формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету.

Метод Фюллеборна. Личинки анкилостомид и стронгилид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После выдерживания в термостате при температуре 25 - 30 °С в течение 5 - 6 часов личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий.

Метод Харада и Мори. В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальной бумаге (15 х 150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Накрывают верхний конец куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер, фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят 8 - 10 суток при температуре 28 °С. Для изучения личинок снимают и удаляют целлофановую крышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 минут, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными таблицы 3.

Таблица 3

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ФИЛЯРИЕВИДНЫХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Для дифференциального определения живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей часто используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцирует метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Критерием состояния яйца является окрашивание зародыша, но не оболочки. Такая его способность связана с условиями гибели яйца. В тех случаях, когда волокнистая оболочка в мертвом яйце не теряет свойств полупроницаемости, она не будет пропускать красители, следовательно, мертвый зародыш не будет окрашиваться. Окрашенный зародыш всегда свидетельствует о гибели яйца.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты - 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают; окрашиваются в синий цвет зародыши мертвых яиц. Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10000 осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному стеклу при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости; после чего этот же препарат просматривают повторно через 2 - 3 часа. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 часов. Мертвые личинки или не выходят из яиц, или окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью).

При определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц возможна окраска препаратов 5%-ным спиртовым раствором йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1 - 3 сек. окрашиваются в оранжевый цвет.

Мертвые яйца описторхисов и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают их сафранином (в разведении 1:10000 спирта 10 °С). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин окрашивает в красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет; яйца с мертвыми зародышами - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином или в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000, или индигокармином в разведении 1:1000 - 1:2000. Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2 - 7 часов.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски:

1. Бриллианткреазиловый синий (1:8000) - через 1 час у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остальной части яйца.

2. Сафранин (1:8000 при воздействии в течение 2 часов и 1:5000 - в течение 3 - 5 часов).

3. 50%-ный раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 часа при температуре 29 - 30 °С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

Люминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции используются не ультрафиолетовые лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю ОИ-18 добавляют специальный набор цветных фильтров.

Живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин, ауролин, сульфат берлерина, трипафлавин, риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные, живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая часть; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых - и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет, у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы.

При вторичной люминесценции (при окраске акридин оранжевым в разведении 1:10000 и 1:50000 от 30 минут до 2 часов) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых яиц аскарид, токсокар, остриц, карликовых цепней, крысиных цепней, бычьего цепня, лентецов окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых яиц аскарид, токсаскарисов, крысиного цепня, широкого лентеца и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши яиц этих гельминтов излучают "горящий" оранжево-красный цвет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в "горящий" светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, в ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет.

Живые яйца трематод (парагонимусов и клонорхисов) не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый цвет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки стронгилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мертвые - ярко-оранжевым светом.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10 - 15 минут после гибели проявляются ярким "горящим" светло-зеленым, а затем - оранжево-красным светом.

Биологическая проба - определение жизнеспособности инвазионных яиц гельминтов посредством их скармливания лабораторным животным. Это наиболее точный метод. Личинками гельминта заражают соответствующего промежуточного или окончательного хозяина, можно использовать также лабораторных животных, которым скармливают зрелые яйца или личинки паразитов.

Например, для определения жизнеспособности яиц аскаридат (аскариды свиные, человека, токсокары, токсаскарис и др.) на одно животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100 - 300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом растворе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морской свинки. Через 6 - 7 суток животное забивают, вскрывают и исследуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аскаридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют их по методу Бермана или Супряги (раздел 6.1.2).

Если животных заражали живыми инвазионными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат.

Для определения жизнеспособности адолескариев фасциол, собранных на растениях в биотопах малого прудовика - промежуточного хозяина паразита, используют мышей, морских свинок или кроликов, которым скармливают эти личинки или вводят их пипеткой через рот.

В случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных животных можно обнаружить у кроликов через 2 месяца, у морских свинок - через 50 суток, у мышей - через 35 - 40 суток.

Для более быстрого получения ответа лабораторных животных вскрывают через 20 - 30 суток и исследуют печень на наличие молодых фасциол.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня также рекомендуется их скармливание незараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92 - 96 часов и выявлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в просвете кишечника.

Для определения жизнеспособности яиц описторхисов рекомендуется метод (Герман С.М., Бэер С.А., 1984), основанный на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки, что приводит к открыванию крышечки яйца и активному выходу мирацидия в экспериментальных условиях.

Взвесь яиц описторхисов в воде предварительно охлаждают до 10 - 12 °С (все последующие операции осуществляют при комнатной температуре 19 - 20 °С). В центрифужную пробирку вносят 1 каплю взвеси, содержащую 100 - 150 яиц. Пробирку ставят в штатив на 5 - 10 минут. За это время все яйца успевают опуститься на дно. Затем полоской фильтровальной бумагой осторожно отсасывают излишек воды и в пробирку добавляют 2 капли специальной среды. Среду готовят на 0,005 М Трис-HCl буфере; в буфер добавляют 12 - 13%-ный раствор этанола и краситель (фуксин, сафранин, эозин, метиленовый синий и т.д.). Пробирку встряхивают, ее содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 10 минут, слегка покачивая. Затем добавляют 2 капли указанной среды. Препарат готов для микроскопирования под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении.

За это время у жизнеспособных личинок открывается крышечка, и мирацидий активно выходит в указанную среду. Благодаря наличию в ней этанола, они через 2 - 5 минут обездвиживаются и затем окрашиваются с помощью красителя. Их легко можно обнаружить и посчитать при микроскопировании.

Церкариозы (церкариальные или шистосоматидные дерматиты; народные названия: "зуд пловцов", "зуд купальщиков", "водяной зуд", "водяная крапива") - паразитарные заболевания, вызываемые личинками (церкариями) ряда видов трематод семейства Schistosomatidae. Во взрослом состоянии они паразитируют в кровеносной системе задних отделов кишечника водоплавающих птиц (утиных, чайковых). Человек играет роль неспецифического (абортивного) хозяина, однако церкарии шистосоматид способны проникать через его кожные покровы, вызывая механические (часто множественные) поражения кожи, оказывая токсическое и сенсибилизирующее воздействие продуктами обмена и распада, способствуя заносу вторичной инфекции.

Основным видом шистосоматид, способным вызывать церкариоз у человека в России, является трематода - Trichobilharzia ocellata (возможно и Т. szidati), в меньшей степени: Bilharziella polonica, Dendtritobilharzia pulverulenta - паразитами утиных птиц, а также - Ornithobilharzia intermedia - паразитом чайковых.

Церкарии шистосоматид относятся к группе "вилкохвостых" (или фуркоцеркарий), т.к. их хвост на конце раздвоен в виде вилки (рис. 2 - не приводится). Похожее строение хвоста имеют и церкарии трематод некоторых других семейств, например Diplostomatidae, Strigeidae, также паразитов водоплавающих птиц, которые, тем не менее, не нападают на человека и не вызывают дерматиты (рис. 3 - не приводится). Учитывать этот факт необходимо для избежания неверной экспертной оценки и ошибочного завышения степени риска заражения человека церкариями в конкретных обследуемых водоемах.

Церкарии Т. ocellata довольно крупные; их общая длина (тело церкарии + стебель хвоста + фурки) достигает 1,0 - 1,3 мм. Более детально размеры церкарий выглядят следующим образом (все цифры даны в микронах): длина тела церкарии вместе с головным органом - 215 - 360, ширина - 50 - 90, длина стебля хвоста - 300 - 375, ширина стебля хвоста - 34 - 45, длина вилок (фурок) хвоста - 200 - 275, диаметр переднего (головного) органа - 60 - 85, диаметр брюшной присоски - 35.

Тело церкарии прозрачное, слегка желтоватого цвета. Железы проникновения (пять пар) колбовидной формы, хорошо видны выводные протоки. На дорзальной поверхности головного органа имеется два пигментированных глазка, расположенных немного впереди брюшной присоски. Стебель хвоста длиннее фурок. Утолщение в передней части стебля хвоста отсутствует. Брюшная присоска церкарии мощная, хорошо заметна (особенно при боковом положении церкарии) и может выпячиваться в виде "трубки".

Церкарии выходят из инвазированных моллюсков преимущественно в дневное время суток. Не совершая дальних активных миграций в водоемах, они оседают на водных растениях, прикрепляясь брюшными присосками. Ежесуточно из инвазированных моллюсков может выходить до 10 и более тысяч церкарий. Будучи потревоженными, они начинают активно плавать и, встречаясь с открытыми кожными покровами теплокровных (птиц, человека), быстро (в течение нескольких секунд) внедряются в них.

Движения живых, вышедших из моллюсков в воду, церкарий (при наблюдении под бинокуляром МБС, при увеличении в 20 - 40 раз) энергичные, как бы "ввинчивающиеся в воду хвостом вперед". Церкарии двигаются в направлении "к свету" и почти мгновенно реагируют на изменения освещенности. Механические колебания воды и растительного субстрата, имитирующие движение лапок утки, стимулируют движения церкарий. Церкарии остаются жизнеспособными и инвазионными в течение двух суток при температуре воды 17 - 20 °С и не менее трех суток при 5 - 10 °С.

Церкарии держатся в поверхностном слое воды или на глубине до 30 - 40 см в тех местах, где преимущественно обитают моллюски - промежуточные хозяева.

Роль промежуточных хозяев Т. ocellata в средней полосе России в основном выполняют моллюски рода Lymnaea: L. auricularia, L. ovata, L. psilia psilia; L. balthica (рис. 3); в меньшей степени: L. stagnalis, L. fragilis, L. palustris; относительно редко: L. intermedia, L. monnardi, L. fontinalis, L. atra. Основное значение (с учетом распространенности, плотности популяций, общей численности в водоемах разных типов, инвазированности возбудителями шистосоматид) имеют первые 4 вида (рис. 4 - не приводится).

Чаще всего моллюски встречаются в мелководных, хорошо прогреваемых участках пойменных озер, прудов, речных заливов, стариц, отстойников, обильно заросших водной растительностью. Распределение и плотность популяций моллюсков в разных зонах водоема могут быть весьма неравномерными - от единичных до 200 - 300 экз./кв. м. Особенно многочисленными могут быть популяции сравнительно мелких видов моллюсков: L. ovata, L. palustris, L. balthica.

Как правило, наиболее высокой численности моллюски достигают в прибрежной полосе шириной от 1 до 10 метров (в среднем - 5 м). Именно эти мелководные участки водоемов представляют наибольшую опасность в отношении риска заражения человека церкариозами.

Пораженность (экстенсивность инвазии) моллюсков шистосоматидами в водоемах не превышает 1 - 3%. Для установления истинной экстенсивности их инвазии шистосоматидами в конкретных водоемах репрезентативная исследуемая выборка моллюсков должна составлять не менее 50 (желательно - 100) экз. каждого вида, встречающегося в водоеме. Моллюсков собирают в прибрежной полосе шириной до 5 м, с грунта или водных растений, вручную или прочным бентосным сачком.

Учитывая особенности биологии легочных моллюсков (сроки жизни, не превышающие 2 лет; период размножения, приходящийся на начало летнего периода, массовая гибель взрослых ("прошлогодних") особей в середине лета, моллюсков на наличие зараженных шистосоматидами особей в популяциях исследуют в первой трети летнего сезона. Моллюсков новой генерации ("сеголеток") исследуют в последней трети летнего и начале осеннего периода.

При исследовании живых моллюсков применяют метод прижизненной диагностики, основанный на положительном фототаксисе церкарий. Он дает наиболее достоверные результаты лишь тогда, когда партеногенетический цикл паразитов в моллюсках завершился формированием церкарий. Моллюсков поштучно рассаживают в бюксы с водой, выставляют под яркий (солнечный или искусственный) свет на 30 - 40 минут. Затем бюксы поочередно просматривают под бинокуляром МБС при увеличении х20 - 30.

В микроаквариумах, где находятся инвазированные моллюски, хорошо заметны активно двигающиеся церкарии. При идентификации следует иметь в виду особенности морфологии церкарий. Прежде всего это касается фуркоцеркарий (с "раздвоенным хвостом"). Церкарий с длинными или короткими не раздвоенными хвостами, относящийся к трематодам других семейств, легко отличить от шистосоматид. Вместе с тем церкарии, имеющие раздвоенный хвост, не обязательно относятся к шистосоматидам. Таким хвостом снабжены церкарии ряда семейств, не имеющих медицинского значения, например Diplostomatidae (в основном рода Diplostomum), Strigeidae (роды: Apatemon, Cotylurus). Церкарии трематод сем. Diplostomatidae (большинство видов рода Diplostomum) отличаются по внешнему виду от церкарий шистосоматид тем, что "в свободном парении" в воде напоминают "крючки" (рис. 2). Церкарии трематод сем. Strigeidae (например, p. Apatemon) отличаются малыми размерами, длина их тела в полтора-два раза меньше церкарий шистосоматид (например, Т. ocellata), при этом длина фурок и стебля хвоста у них примерно одинаковы (рис. 2).

Для более детального исследования церкарий применяют метод компрессии гепатопанкреаса моллюсков. Тела исследуемых моллюсков (поштучно) извлекают пинцетом из раковин, раздавливают между двумя предметными стеклами и просматривают под малым увеличением (х40 - 60) обычного светового микроскопа.

Обследование водоема (серии водоемов, отдельных их зон) должно завершаться экспертным заключением: "Об опасности водоема(ов) в отношении риска заражения людей церкариозами". Прежде всего это необходимо в отношении водоемов, имеющих рекреационное значение, т.е. расположенных в зонах отдыха людей и разрешенных для купания.

Для составления экспертного заключения необходима первичная информация, получаемая при комплексном обследовании водоема. Обследования проводят в середине дня при солнечной погоде (т.е. при условиях максимальной активности промежуточных хозяев и церкарий шистосоматид). Информацию по нижеприведенным показателям заносят в лабораторный журнал или компьютерную базу данных. Учитывают следующие показатели:

1 - географическое положение водоема и его название;

2 - дата проведения обследования и метеоусловия;

3 - тип водоема (одиночное озеро; одиночный пруд; система сообщающихся прудов или озер; участок реки; участок канала, система водоемов, образованных в результате зарегулирования русла реки; участок водохранилища; отстойник и др.);

4 - площадь обследуемой акватории;

5 - число обследованных стаций (число обследованных в водоеме прибрежных участков длиной 5 м, шириной 1 - 2 м);

6 - видовой состав легочных моллюсков, обнаруженных в водоеме и собранных для лабораторных исследований с целью определения пораженности церкариями шистосоматид;

7 - плотность популяций моллюсков (рассчитывается по среднему числу особей на 1 кв. м);

8 - число моллюсков, взятых для лабораторных исследований (указывать отдельно для каждого вида моллюсков);

9 - экстенсивность инвазии моллюсков шистосоматидами (число инвазированных от числа исследованных в процентах для каждого вида моллюсков);

10 - степень зарастания водоема (растительности нет; зарастание слабое (менее 10 стеблей на 1 кв. м); зарастание умеренное и сильное (более 10 стеблей на 1 кв. м); наличие плавающей растительности);

11 - характер фоновой растительности (учитываются: элодея, рдесты, осоки, роголистник, нимфеи, частуха, стрелолист, плавающая растительность (прежде всего ряска), крупные макрофиты (тростник, камыш, рогоз, аир);

12 - наличие в водоеме утиных птиц (прежде всего кряквы). Указывают численность птиц на момент обследования;

13 - степень загрязненности водоема (остатки пищи, остатки предметов быта, промышленные отходы, строительный мусор и др.) Водоем (его участок) загрязнен слабо: менее 3 указанных выше предметов загрязнения на 10 м прибрежной акватории шириной 3 м; водоем (его участок) загрязнен умеренно или сильно: более 3 предметов загрязнения в той же акватории;

14 - использование водоема в рекреационных целях ("ДА", "НЕТ"; отдельно указывают: используется ли водоем или отдельный его участок, как официально разрешенное место для купания людей);

15 - благоустроенность водоема: водоем полностью бетонирован, полностью или частично бетонирована береговая линия, производится или нет регулярная очистка от мусора и растительности, имеются или нет оснащенные пляжные территории и огороженные от остальных мест акватории для купания с песчаным грунтом без растительности, имеются или нет (на остальных береговых участках или в целом на несанкционированных для купания водоемах) знаки, запрещающие купание, подкормку птиц, свалку мусора.

На основании проведенных полевых и лабораторных исследований составляют экспертное заключение об эпидемической опасности водоема (серии водоемов, отдельных их участков) в отношении риска заражения людей церкариозом. При этом делают вывод о том, что:

1 - риск заражения отсутствует (либо: нет экологических условий, благоприятных для обитания промежуточных хозяев возбудителей и нет легочных моллюсков, либо: нет источника заражения, либо: отсутствуют оба эти фактора);

2 - имеется потенциальный риск заражения (на исследуемой территории в принципе имеется источник инвазии (водоплавающие, прежде всего утиные, птицы) и имеются популяции промежуточных хозяев возбудителя (одного или нескольких видов легочных моллюсков). Однако на период обследования водоема в исследованной выборке моллюсков не выявлены особи, зараженные церкариями шистосоматид);

3 - риск заражения присутствует (имеются популяции легочных моллюсков и в исследованной выборке обнаружены особи, зараженные шистосоматидами).

Во избежание ошибочного суждения о степени риска, и учитывая, что этот показатель изменчив в зависимости от целого ряда условий, определением "риск заражения присутствует", как правило, целесообразно ограничиться.

Когда ряд факторов со всей очевидностью указывает на высокий риск заражения в конкретных водоемах или их отдельных участках (обнаружена высокая численность популяций промежуточных хозяев, выявлена высокая пораженность моллюсков церкариями шистосоматид, имеется обильное зарастание водоема при одновременно его слабо выраженной загрязненности, водоем фактически используется для купания, особенно детьми, даже в тех случаях, когда он официально не признан рекреационной зоной), в экспертном заключении этот факт следует особо подчеркивать.

Заключение

Широкое распространение паразитарных болезней среди людей и животных способствует интенсивному обсеменению окружающей среды их возбудителями (яйца аскарид, власоглава, описторхиса, онкосферы тениид, цисты амеб, лямблий, балантидий, ооцисты криптоспоридий и др.).

Выявление возбудителей паразитозов (яйца и личинки гельминтов, цисты кишечных патогенных простейших) - наиболее точный показатель санитарно-эпидемиологического неблагополучия (фекального загрязнения) объектов окружающей среды и представляет значительный интерес для эпидемиологов и санитарных врачей. Поэтому наряду с бактериологическими, химическими, вирусологическими обязательны и санитарно-паразитологические исследования объектов окружающей среды.

Возбудителей инвазий обнаруживают в почве, воде, предметах обихода, овощах, столовой зелени (абиотическая среда), в организмах окончательных, промежуточных и дополнительных хозяев (биотическая среда).

Санитарно-паразитологический контроль за состоянием среды обитания человека является важной составной частью профилактической работы органов и учреждений здравоохранения.

Санитарно-оздоровительные и профилактические мероприятия с обеззараживанием источников инвазии и строгим лабораторным контролем за работой сооружений по подготовке питьевой воды, очистке сточных вод и животноводческих стоков, обезвреживанием нечистот, осадков сточных вод перед сбросом в поверхностные водоемы или на поля для удобрения и орошения сельскохозяйственных культур на данном этапе являются ведущими.

Лабораторные методы санитарно-паразитологических исследований являются основным и часто единственным способом установить степень риска заражения населения возбудителями гельминтозов и кишечных протозоозов. На основе анализа показателей степени загрузки объектов окружающей среды инвазионным материалом нечистот, динамики снижения инвазированности и заболеваемости населения и пораженности эпидемически значимых животных прогнозируется направленность изменения риска заражения и условия улучшения паразитологической ситуации как по отдельным инвазиям, так и по группам паразитозов.

Результаты лабораторных санитарно-паразитологических исследований позволяют оценивать обсемененность окружающей среды возбудителями паразитозов, риск новых заражений, прогнозировать заболеваемость населения и на основе этого планировать санитарные, противоэпидемические и лечебно-профилактические мероприятия, а также контролировать их эффективность.

Список литературы

1. Гигиенические требования к использованию сточных вод и их осадков для орошения и удобрения. СанПиН 2.1.7.573-96.

2. Требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. СанПиН 2.1.4.559-96.

3. Санитарно-паразитологическое исследование воды. МУК 4.2.668-97. М., 1997. 10 с.

4. Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического исследования. ГОСТ 17.4.4.02-84.

5. Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест. МУ 2.1.7.730-99.

6. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования окружающей среды. М.: Росагропромиздат, 1991. 145 с.