Законодательная база Российской Федерации

"МЕТОДЫ САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.796-99" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22.12.99)

Почва. Для проведения экспериментальных исследований по изучению сроков выживаемости цист патогенных кишечных простейших следует использовать цисты лямблий. Они, при наличии одинаковых микроклиматических условий в окружающей среде, не отличаются по своей устойчивости от таковой цист дизентерийных амеб. Цисты лямблий выделяют из фекалий больных людей методом механического обогащения.

Для проведения опытов из взвеси цист лямблий готовят специальные тест-объекты: на мембранные фильтры N 4 или N 6 наносят 0,2 мл взвеси, содержащей не менее 4 - 5 тысяч жизнеспособных цист. Фильтры складывают по типу конверта и помещают в капроновые мешочки размером 3 х 2,5 см, которые вкладывают в среднюю, нижнюю и верхнюю части перфорированных алюминиевых трубок длиной 10 см, диаметром 2 х 2,5 см, содержащих почву с подопытных участков. Трубки с пробами цист кишечных простейших размещают на расстоянии 8 - 10 см друг от друга в алюминиевой сетке сечением 30 х 50 см и высотой 7 - 10 см, которая предварительно заполняется почвой с подопытного участка. Сетку закапывают в почву на такую глубину, чтобы верхний конец алюминиевых трубок находился на уровне поверхности почвы. Сетку засыпают сверху тонким слоем почвы подопытного участка.

Трубки с пробами цист кишечных простейших вынимают из почвы и доставляют в лабораторию для исследования 1 раз в неделю. Извлеченные из трубок капроновые мешочки ополаскивают чистой водой. Жизнеспособные и погибшие цисты кишечных простейших, содержащиеся на мембранных фильтрах, могут быть идентифицированы под люминесцентным микроскопом при помощи акридинового оранжевого. На предметное стекло наносят каплю 0,1 - 0,2%-ного водного раствора акридинового оранжевого и делают отпечаток с развернутого фильтра, извлеченного из капронового мешочка. Тщательно смывают красителем с фильтра взвесь цист. Полученную на предметном стекле смесь накрывают покровным стеклом и спустя 30 - 45 минут исследуют под люминесцентным микроскопом.

У живых цист наблюдается лишь слегка окрашенная в оранжевый цвет оболочка, а цитоплазма имеет темноватый оттенок. Цитоплазма и оболочка у погибших цист окрашивается в красный или красно-кирпичный цвет.

При отсутствии в лаборатории люминесцентного микроскопа идентификацию жизнеспособных и нежизнеспособных цист кишечных простейших осуществляют под световым микроскопом в препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым. Препараты готовят в этом случае по той же методике, что и при люминесцентной микроскопии. Под световым микроскопом жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают желтую окраску.

Для определения соотношения между жизнеспособными и нежизнеспособными цистами достаточно подсчитать их число в 3 - 5 рядах покровного стекла. Число жизнеспособных и погибших цист, содержащихся в исследуемой пробе, определяют по формуле:

Х = А х В х С х Д,

где:

Х - число живых или погибших цист соответствующего вида кишечных простейших, содержащихся в пробе;

А - число цист, обнаруженных в 1 ряду под покровным стеклом;

В - число рядов покровного стекла, которое было использовано для подсчета цист;

С - число капель в 1 мл смыва;

Д - объем смыва с мембранного фильтра (мл).

О динамике отмирания цист судят по изменению количественного соотношения между жизнеспособными и погибшими цистами.

Сточные воды. Первый этап приготовления тест-объектов в мембранных фильтрах, вложенных в капроновые мешочки, остается таким же, как и при определении сроков выживаемости цист кишечных простейших в почве. Затем мешочки перевязывают сверху нитками и погружают в пробирки высотой 10 - 15 см, диаметром 2 см. В пробирки наливают изотонический раствор натрия хлорида для предупреждения гибели цист до момента погружения пробирок в сточную воду. Для того, чтобы предупредить всплывание в пробирке мешочков с пакетиками исследуемого материала, в них вкладывают кусочки гранита величиной с фасоль. Пробирки с исследуемым материалом помещают в перфорированные жестяные банки, к которым прикрепляется тонкая медная проволока. Перед погружением банок в исследуемую сточную воду изотонический раствор натрия хлорида из пробирок удаляют. Банки с пробками фиксируют при помощи проволоки в условиях опытной канализационной установки. Пробы для исследования извлекают 1 раз в неделю и обрабатывают по той же методике, что и почву.

Поверхность твердых материалов. Обогащенную взвесь цист кишечных простейших объемом 0,2 мл наносят тонким слоем на поверхность опытных образцов, которые помещают в емкости, позволяющие активно регулировать температуру и относительную влажность воздуха. В качестве таких емкостей можно использовать термостат и холодильник, необходимая температура в которых устанавливается при помощи терморегуляторов. Обеспечение необходимой влажности воздуха достигается путем помещения в указанные емкости соответствующего количества чашек Петри с дистиллированной водой, в которой увлажняются полоски из марли. Выживаемость цист целесообразно изучать при температуре 2 - 6 °С и 18 - 27 °С, относительной влажности воздуха 40 - 65% и 80 - 100%. Определение температуры и относительной влажности воздуха производят при помощи термовлагобарометра БМ-2.

Жизнеспособность цист определяют при помощи методов витального окрашивания и люминесцентной микроскопии.

Для того, чтобы установить предельные сроки выживаемости и интенсивность гибели цист кишечных простейших на поверхности опытных образцов, изготовленных из стекла, на изучаемую взвесь цист наносят через определенные промежутки времени каплю 0,1%-ного водного раствора эозина или 1 каплю 0,1 - 0,2%-ного водного раствора акридинового оранжевого, тщательно растирают в ней исследуемую взвесь, покрывают покровным стеклом и просматривают приготовленные препараты соответственно при помощи светового или люминесцентного микроскопа. При изучении выживаемости цист кишечных простейших на опытных образцах, изготовленных из светонепроницаемых материалов (металлы, дерево, полимеры, картон и др.), исследуемую взвесь цист вначале тщательно смешивают на поверхности опытного образца с водным раствором соответствующего красителя, затем каплю этой взвеси переносят на предметное стекло, покрывают ее покровным стеклом и анализируют под световым или люминесцентным микроскопом. В препаратах, окрашенных раствором эозина, жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают розовую окраску. Характер окраски живых и погибших цист при применении акридинового оранжевого под световым и люминесцентным микроскопом такой же, как и при определении их жизнеспособности в почве.