Законодательная база Российской Федерации

"ПРОДУКТЫ МОЛОЧНЫЕ. ЙОГУРТЫ. ОБЩИЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ. ГОСТ Р 51331-99" (утв. Постановлением Госстандарта РФ от 19.10.99 N 355-ст)

Метод основан на высеве определенного количества продукта и (или) его разведений в жидкие или агаризованные селективные питательные среды, культивировании посевов при оптимальных условиях, учете полученных результатов и, при необходимости, определении морфологических и биохимических свойств обнаруженных микроорганизмов и их подсчете. Метод используют при текущем производственном контроле.

7.17.1 Отбор и подготовка проб

7.17.1.1 Отбор проб йогурта и подготовка его к анализу по ГОСТ 9225.

7.17.2 Средства измерения, аппаратура, материалы и реактивы.

7.17.2.1 Для проведения испытания принимают аппаратуру, материалы, реактивы по ГОСТ 9225.

7.17.3 Подготовка к испытанию

7.17.3.1 Растворы для приготовления десятикратных разведений готовят в соответствии с ГОСТ 9225.

7.17.3.2 Питательные среды готовят в соответствии с ГОСТ 10444.11.

7.17.4 Проведение испытания

7.17.4.1 Приготовление разведений продукта проводят в соответствии с ГОСТ 9225 и ГОСТ 10444.11.

7.17.4.2 Посев для подсчета молочнокислых бактерий (термофильный молочнокислый стрептококк, болгарская и ацидофильная молочнокислые палочки, в случае использования) проводят в стерильное обезжиренное молоко. Для этого по 1 см3 из шестого, седьмого, восьмого и девятого десятикратных разведений йогурта вносят в две пробирки со стерильным обезжиренным молоком.

7.17.4.3 Пробирки с посевами помещают в термостат и инкубируют при (37±1) °С в течение 72 ч.

7.17.5 Обработка результатов

7.17.5.1 Обработку результатов испытаний йогурта по определению количества молочнокислых бактерий, а также при необходимости дифференцированного учета - количества термофильного молочнокислого стрептококка и болгарской палочки проводят по ГОСТ 10444.11.

7.18 Метод определения молочнокислых микроорганизмов (Lactobacfflus delbrueckii subsp. bul-garicus и Streptococcus thermophilus) в йогурте (посев на твердые среды)

7.18.1 Настоящий метод предназначен для подсчета специфических микроорганизмов йогурта и основан на высеве определенного количества продукта и (или) его разведений на агаризованные селективные питательные среды, культивировании посевов при оптимальных условиях, учете полученных результатов и, при необходимости, определении морфологических и биохимических свойств обнаруженных микроорганизмов и их подсчете.

7.18.1.1 Lactobacfflus delbruecki subsp. bulgaricus: термофильный микроорганизм, который образует чечевицеобразные с четко очерченными краями колонии диаметром 1-3 мм на подкисленной среде MRS при условиях, описанных в настоящей методике.

Микроскопический препарат: палочки, обычно короткие, но иногда образуются и более длинные, неспорообразующие, грамположительные, неподвижные и каталазоотрицательные.

7.18.1.2 Streptococcus thermophilus: термофильный микроорганизм, который образует чечевицеобразные колонии диаметром 1-2 мм на питательной среде М17 при условиях, описанных настоящим методом.

Микроскопический препарат: клетки шарообразной формы (0,7-0,9 мкм в диаметре) в парах или длинных цепочках, грамположительные и каталазоотрицательные.

7.18.2 Средства измерения, аппаратура, материалы и реактивы.

7.18.2.1 Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 9225, а также дополнительно:

- микроанаэростат или эксикатор, или емкость с герметично закрывающейся крышкой;

- анаэробный агент: анаэробная система: FN 25 - supplier-OXOID;

- пептон 1 (триптический перевар казеина), закупаемый по импорту;

- пептон 2 (триптический перевар мяса), закупаемый по импорту;

- питательные среды MRS, M17, закупаемые по импорту.

7.18.3 Растворы, питательные среды и реактивы

7.18.3.1 Раствор для приготовления разведений

Состав:

- пептон 1 (триптический перевар казеина) - 0,5 г;

- пептон 2 (триптический перевар мяса) - 0,5 г;

- дистиллированная вода - 1000 см3.

Приготовление:

пептоны растворяют в воде. Разливают по 100 см3 в бутылочки или колбочки. Стерилизуют при (121±1) °С в течение (15±1) мин.

7.18.3.2 Питательные среды

7.18.3.2.1 Подкисленная среда MRS

Состав:

- пептон 1 - 10 г;

- мясной экстракт - 10 г;

- дрожжевой экстракт - 5 г;

- глюкоза - 20 г;

- твин 80 - 1 см3;

- фосфат калия однозамещенный - 2 г;

- ацетат натрия тригидрат - 5 г;

- диаммоний цитрат - 2 г;

- сернокислый магний (MgSO4·7H2O) - 0,2 г;

- сернокислый марганец (MnSO4·4H2O) - 0,05 г;

- агар - 9-18 г;

- дистиллированная вода- 1000 см3.

Приготовление:

компоненты растворяют в кипящей воде. Охлаждают до 50 °С и с помощью уксусной кислоты устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации pH составил 5,4 при 25 °С. Готовую среду разливают в бутылочки по 100 и 200 см3. Стерилизуют при (121±1) °С в течение (15±1) мин.

7.18.3.2.2 Питательная среда М17

7.18.3.2.2.1 Основная среда

Состав:

- пептон 1 - 2,5 г;

- пептон 2 - 2,5 г;

- пептон 3 (перевар сои) - 5,0 г;

- дрожжевой экстракт - 2,5 г;

- мясной экстракт - 5,0 г;

- глицерофосфат (C3H7O6PNa2) - 19,0 г;

- сернокислый магний (MgSO4·7H2O) - 0,25 г;

- аскорбиновая кислота - 0,5 г;

- агар - 9-18 г;

- дистиллированная вода - 950 см3.

Приготовление:

все компоненты растворяют в кипящей воде. Охлаждают до 50 °С. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации pH был в пределах 7,1-7,2. Готовую среду разливают в бутылочки по 95 см3. Стерилизуют при (121±1) °С в течение (15±1) мин.

7.18.3.2.2.2 Раствор лактозы

Состав:

- лактоза- 10 г;

- дистиллированная вода- 100 см3.

Приготовление:

лактозу растворяют в воде, стерилизуют при (121±1) °С в течение (15±1) мин.

7.18.3.2.2.3 Полная среда

Состав:

- основная среда (7.18.3.2.2.1) - 95 см3;

- раствор лактозы (7.18.3.2.2.2) - 5 см3.

Приготовление:

Непосредственно перед использованием расплавляют основную среду в водяной бане и охлаждают до 48-50 °С. Подогревают раствор лактозы до 48-50 °С. Добавляют раствор лактозы к основной среде и перемешивают.

7.18.4 Подготовка образцов и проб

7.18.4.1 Перед вскрытием поверхность упаковки йогурта обмывают, протирают, удаляя грязь, которая может загрязнить йогурт. Затем поверхность протирают 70 %-ным этиловым спиртом. Упаковки с йогуртом вскрывают в условиях, приближенных к асептике.

7.18.4.1.1 Йогурт

Навеску йогурта массой (10±1) г помещают в стерильную посуду и тщательно перемешивают с использованием стерильных приспособлений или блендера.

7.18.4.1.2 Йогурт фруктовый (овощной)

Тщательно перемешивают все содержимое упаковки с йогуртом с использованием блендера (измельчителя). Затем отбирают (10±1) г образца для исследования.

7.18.4.2 Микроскопические исследования

Готовят микроскопический препарат йогурта, окрашивают метиленовым голубым (например, спиртовым раствором метиленового голубого - 6 г/дм3), затем просматривают несколько полей зрения под микроскопом, чтобы определить соотношение двух бактериальных видов (кокки и палочки) и выбрать разведения для их количественного учета. Как правило, для подсчета палочек используют пятое или шестое разведение, для подсчета стрептококков - седьмое или восьмое разведение.

7.18.4.3 Приготовление первого разведения

К пробе йогурта, приготовленной в соответствии с 7.18.4.1.1 или 7.18.4.1.2, добавляют раствор (7.18.3.1), пока общий объем не достигнет 50 см3. Перемешивают на блендере в течение 1 мин. Затем добавляют раствор (7.18.3.1), пока общий объем не достигнет 100 см3. Таким образом получают первое разведение.

7.18.4.4 Приготовление десятикратных разведений

В пробирку с 9 см3 раствора пептонов (7.18.3.1) вносят 1 см3 первого разведения йогурта. Смесь тщательно перемешивают в течение 10 с. Таким образом получают второе разведение. Повторяют эту операцию до получения серии требуемых разведений.

7.18.4.5 Посев и инкубация

7.18.4.5.1 Для определения количества L. bulgaricus и S. thermophilus засевают по 1 см3 каждого разведения в две чашки Петри для определения каждого вида микроорганизмов.

7.18.4.5.2 При определении L. bulgaricus в каждую чашку Петри наливают по 12-15 см3 расплавленной подкисленной среды MRS (7.18.3.2.1) температурой (45±1) °С.

7.18.4.5.3 При определении S. thermophilus в каждую чашку Петри наливают по 12-15 см3 расплавленной среды М17 (7.18.3.2.2) температурой (45±1) °С.

7.18.4.5.4 Тщательно перемешивают содержимое чашек Петри немедленно после внесения в них питательной среды и затем оставляют для застывания среды чашки на горизонтальной холодной поверхности.

7.18.4.5.5 Затем чашки переворачивают донышком вверх и складывают одну на другую (не более 6 штук) и ставят в термостат.

7.18.4.5.6 Чашки Петри для подсчета L. bulgaricus термостатируют при (37±10) °С в течение 72 ч в анаэробных условиях.

7.18.4.5.7 Чашки Петри для подсчета S. thermophilus термостатируют при (37±1) °С в течение 48 ч.

7.18.4.6 Подсчет колоний

После инкубации подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри. Для подсчета используют чашки, на которых выросло от 10 до 300 колоний.

Чашки просматривают в проходящем свете. Для ускорения подсчета может быть использовано специальное оборудование для подсчета колоний.

7.18.4.7 Подтверждение

Выбирают колонии, которые использовались при подсчете, и готовят микроскопический препарат, окрашивают по Граму. На среде MRS должны вырастать грамположительные, неспорообразующие каталазоотрицательные палочки, а на среде М17 - грамположительные каталазоотрицательные цепочки кокков или диплококки.

7.18.4.8 Обработка результатов

7.18.4.8.1 Количество каждого вида микроорганизмов N (КОЕ/г) определяют по формуле

где С - сумма колоний L. bulgaricus или L. thermophilus, подсчитанных по 7.18.4.6 на соответствующих чашках;

n_1 - количество чашек, соответствующих L. bulgariicus или L. thermophilus, подсчитанных в самом низком разведении;

n_2 - количество чашек, соответствующих L. bulgaricus или L. thermophilus, подсчитанных в самом высоком разведении;

d- число, соответствующее значению разведения для каждого вида микроорганизмов, из которого был произведен первый подсчет.

7.18.4.8.2 Общее количество молочнокислых бактерий (КОЕ/г) в йогурте определяют путем суммирования количества L. bulgaricus (КОЕ/г) и L. thermophilus (КОЕ/г).

7.18.4.8.3 Пример подсчета

При подсчете L. bulgaricus на чашках Петри были получены следующие результаты:

10(-5) разведение - 295 и 245 колоний;

10(-6) разведение - 33 и 40 колоний,

следовательно,

При подсчете S. thermophilus на чашках Петри были получены следующие результаты:

10(-5) разведение - 280 и 240 колоний

10(-6) разведение - 30 и 38 колоний,

следовательно,

Общее количество молочнокислых бактерий равно:

7.19 Метод определения бифидобактерий (Bifidobacterium) в биойогурте (посев на твердые среды)

Метод основан на высеве определенного количества продукта и (или) его разведений в агаризованные селективные питательные среды, культивировании посевов при оптимальных условиях, учете результатов по характерным признакам и, при необходимости, определении морфологических свойств обнаруженных микроорганизмов и их подсчете.

7.19.1 Отбор и подготовка проб

7.19.1.1 Отбор проб биойогурта и подготовка его к анализу - по ГОСТ 9225 и 7.17.4.1 настоящего стандарта.

7.19.2 Средства измерения, аппаратура, материалы и реактивы

7.19.2.1 Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 9225, а также дополнительно:

- микроанаэростат или эксикатор, или емкость с герметично закрывающейся крышкой;

- анаэробный агент: анаэробная система: AN 25 - supplier-OXOID;

- система для стерилизации фильтрацией фирмы Sartorius или аналогичные системы других фирм (0,45 мкм);

- диклоксациллин Sigma D 9016;

- питательная среда MRS, закупаемая по импорту;

- кукурузно-лактозная среда (ГМК-1) для количественного учета микроорганизмов по [8].

7.19.3 Подготовка к испытанию

7.19.3.1 Растворы для приготовления разведений готовят в соответствии с ГОСТ 9225 и 7.18.3.1 настоящего стандарта.

7.19.3.2 Питательные среды

7.19.3.2.1 Питательная среда MRS с диклоксациллином

7.19.3.2.1.1 Состав питательной среды MRS:

- пептон - 10 г;

- мясной экстракт - 10 г;

- дрожжевой экстракт - 5 г;

- глюкоза - 20 г;

- твин 80 - 1 см3;

- фосфат калия однозамещенный - 2 г;

- ацетат натрия тригидрат - 5 г;

- диаммоний цитрат - 2 г;

- сернокислый магний (MgSO4·7H2O) - 0,2 г;

- сернокислый марганец (Mn2SO4·4H2O) - 0,5 г;

- агар - 15 г;

- дистиллированная вода - 1000 см3.

7.19.3.2.1.2 Приготовление раствора селективного агента

Состав:

- диклоксациллин - 25 мг Sigma D 9016;

- дистиллированная вода - 50 см3.

Диклоксациллин растворяют в дистиллированной воде, затем полученный раствор стерилизуют фильтрацией, срок хранения раствора - 15 сут при 4 °С.

В момент использования готовят разведение этого раствора 1:10.

7.19.3.2.1.3 Приготовление антиоксидантного раствора

Состав:

L-цистеин гидрохлорид - 3 г Sigma С 7880;

дистиллированная вода - 100 см3.

Растворяют хлористый цистеин в дистиллированной воде, затем полученный раствор стерилизуют фильтрацией. Раствор разливают по 10 см3 в стерильные пробирки. Хранят 15 сут при 4 °С.

Приготовление питательной среды:

вносят 15 г агара в колбу с 500 см3 дистиллированной воды, которую помещают в кипящую водяную баню до полного растворения агара. Вносят 55 г сухой среды MRS в другую колбу с 500 см3 дистиллированной воды температурой 50 °С. Смешивают оба раствора и хорошо перемешивают. Если необходимо, то устанавливают pH перед стерилизацией так, чтобы после автоклавирования pH составил (6,5±0,2) при 25 °С.

Полученную среду разливают по 100 см3 в бутылочки. Стерилизуют при (121±1) °С в течение 15 мин. Питательную среду хранят в темном месте в течение одного месяца при (0-5) °С.

Перед использованием среду расплавляют и выдерживают в кипящей водяной бане в течение 20 мин для регенерации среды. Затем среду охлаждают до (48±1) °С и вносят в каждую бутылочку 1 см3 раствора селективного агента (7.19.3.2.1.2) и 1 см3 раствора антиоксиданта (7.19.3.2.1.3). Смесь аккуратно перемешивают, чтобы не было насыщения среды кислородом.

7.19.3.2.2 Питательная среда ГМК-1

Состав:

- кукурузно-молочная смесь - 30 г;

- пептон - 30 г;

- лактоза - 18 г;

- аскорбиновая кислота - 1 г;

- натрий лимоннокислый (трехзамещенный) - 12 г;

- магний сернокислый - 0,24 г;

- калий фосфорнокислый (однозамещенный) - 4 г;

- натрий фосфорнокислый (двузамещенный) - 2 г;

- агар - 6 г;

- дистиллированная вода - 2000 см3.

Приготовление:

50 г сухой питательной среды вносят в 1000 см3 дистиллированной воды, нагревают до полного растворения, при наличии осадка фильтруют через ватный фильтр, устанавливают pH (7,2±0,2) с помощью раствора аммиака массовой долей 25 % или раствора гидроокиси натрия массовой долей 40 %. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по (10±0,5) или (20±0,5) см3 и стерилизуют при (121±1) °С в течение (10±2) мин.

Перед использованием пробирки со средой помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 20 мин для регенерации среды. Затем охлаждают среду до (48±1) °С и в каждую пробирку с 10 см3 среды вносят 0,1 см3 селективного агента (7.19.3.2.1.2) и в пробирку с 20 см3 среды вносят 0,2 см3 селективного агента (7.19.3.2.1.2). Содержимое пробирок осторожно перемешивают.

7.19.4 Подготовка образцов и проб

Подготовку образцов и проб проводят в соответствии с 7.18.4.1; 7.18.4.3; 7.18.4.4 настоящего стандарта. Десятикратные разведения продукта готовят от 1-го до 8-го. При приготовлении проб все перемешивания проводят максимально осторожно, чтобы исключить насыщение кислородом.

7.19.5 Посев и инкубация

7.19.5.1 Для определения количества бифидобактерий засевают по 1 см3 из четырех последних разведений в две чашки Петри <*>.

<*> Допускается проведение посева разведений продукта в пробирки с высоким столбиком среды (7.19.3.2.2), с последующей выдержкой в термостате при (37±1) °С в течение 5 сут.

7.19.5.2 В каждую чашку Петри заливают по 12-15 см3 регенерированной среды (7.19.3.2.1) температурой (45±1) °С.

7.19.5.3 Содержимое чашек Петри осторожно перемешивают и оставляют для застывания.

7.19.5.4 После застывания чашки Петри переворачивают донышком вверх и помещают в емкости (7.19.2.1), в которые вкладывают анаэробный агент.

7.19.5.5 Термостатирование чашек Петри осуществляют при (37±1) °С в течение 5 сут в анаэробных условиях.

7.19.5.6 Подсчет колоний

После инкубации подсчитывают количество колоний на чашках Петри. Для подсчета используют чашки, на которых выросло от 10 до 300 колоний. Если колонии имеют гетерогенный вид, необходимо сделать микроскопические препараты нескольких колоний для подтверждения их принадлежности к Bifidobacterium.

7.19.5.7 Обработка результатов.

Количество бифидобактерий в пробе N, КОЕ/г, определяют по формуле

где С - сумма колоний, подсчитанных на чашках;

n_1 - количество чашек, подсчитанных в самом низком разведении;

n_2 - количество чашек, подсчитанных в самом высоком разведении;

d - величина первого разведения, взятого для подсчета.

7.19.5.8 Пример для подсчета

10(-5) разведение - 295 и 245 колоний;

10(-6) разведение - 33 и 40 колоний, тогда

7.20 Определение массовой доли витаминов осуществляют по методам, утвержденным Минздравом России.

7.21 Определение содержания микотоксинов, антибиотиков и радионуклидов осуществляют по методам, утвержденным в установленном порядке.

7.22 Определение пестицидов - по ГОСТ 23452 и методам, утвержденным органами Госсанэпиднадзора Минздрава России.

7.23 Определение токсичных элементов:

- ртути - по ГОСТ 26927 и по [13];

- мышьяка - по ГОСТ 26930;

- меди - по ГОСТ 26931, ГОСТ 30178;

- свинца - по ГОСТ 26932, ГОСТ 30178;

- цинка - по ГОСТ 26934, ГОСТ 30178;

- кадмия - по ГОСТ 26933, ГОСТ 30178.

7.24 В нормативную (техническую) документацию допускается включать прописи аттестованных методик выполнения измерений показателей конкретного вида продукции, соответствующих ГОСТ Р 8.563 и внесенных в Государственный или Отраслевой реестры методик выполнения измерений, метрологические характеристики которых не хуже приведенных в данном стандарте.