Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава СССР от 02.09.85 N 1161 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА" (вместе с "ИНСТРУКЦИЕЙ ПО ПОСТАНОВКЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА СИФИЛИС")

Принцип

При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген-антитело), выпадающий в виде хлопьев белого цвета.

Оборудование, необходимое для взятия крови из пальца и вены и постановки реакции

Капиллярные пипетки аппарата Панченкова.

Градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл.

Пастеровские пипетки.

Пробирки длиной 8-10 см и 14-15 см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные.

Пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см.

Иглы для взятия крови из пальца и из вены.

Резиновая груша.

Центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин.

Аппарат для встряхивания.

Стерилизатор для кипячения игл, шприцев, инструментов.

Ингредиенты

Антиген кардиолипиновый для микрореакции.

Холин-хлорид (включается в упаковку с антигеном).

Натрий хлорид х.ч.

Натрий лимоннокислый (цитрат натрия) трехзамещенный (Na3C6H5O7 x 5H2O).

Мертиолат C9H9O2S NaHg.

Растворы

Изотонический раствор хлорида натрия 0,9%.

10% раствор холин-хлорида. Готовится следующим образом: к 29,65 мл изотонического раствора натрия хлорида добавляют 0,35 мл 0,01% раствора мертиолата и 5 мл 70% раствора холин-хлорида. Смесь тщательно перемешивают. При отсутствии мертиолата для приготовления 10% раствора холин-хлорида необходимо к 30 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида добавить 5 мл 70% раствора холин-хлорида. Раствор стойкий, при отсутствии бактериального загрязнения хранится 10-12 месяцев при 4°.

5% раствор трехзамещенного цитрата натрия готовится на дистиллированной воде и фильтруется. Раствор не стоек. При помутнении его надо заменять свежим. Хранится в холодильнике при 4° в течение 5-6 дней.

Контрольные лиофилизированные сыворотки крови, необходимые для установления пригодности эмульсии антигена, выпускает Каунасское предприятие по производству бактерийных препаратов. Отрицательную и положительную сыворотки крови используют неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. При отсутствии лиофилизированных сывороток крови используют нативную положительную или смесь положительных в РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции инактивированных сывороток крови, которые, с целью экономии, разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки реакции свежую или размороженную в одной пробирке сыворотку крови титруют на пластинке для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня в качестве контроля.

Титрование сыворотки крови проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 3 капли изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунку по 3 капли положительной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пастеровской пипеткой, насасывая и выпуская его в лупку 5-6 раз. Затем набирают часть содержимого второй лупки в пастеровскую пипетку и три капли переносят в третью лунку, а оставшуюся в пипетке сыворотку крови возвращают во вторую лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и три капли переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки три капли удаляют. Во все лунки добавляют по одной капле эмульсин кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают ручным способом или в аппарате для встряхивания в течение 5 минут, добавляют по три капли изотонического раствора натрия хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после этого регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/2+), используют в качестве слабоположительнго контроля. Для получения его делают соответствующее разведение. Например, если слабоположительный результат получен с разведением сыворотки крови 1 : 8, то для получения контрольной слабоположительной сыворотки крови в пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.

При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения наблюдается равномерное уменьшение величины хлопьев преципитата.

При снижении реактивности хранящейся контрольной сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови можно использовать до тех пор, пока она дает положительный результат (4+- в разведении не ниже, чем 1 : 2, и слабоположительный результат (2+) в разведении не меньше, чем 1 : 4. При дальнейшем снижении реактивности употреблявшуюся положительную контрольную сыворотку крови заменяют новой.

При хранении контрольных сывороток крови не допускаются повторные замораживания их и оттаивания, т.к. в этом случае реактивность их снижается.

О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не эмульсии антигена, судят по параллельному титрованию этой сыворотки крови с использованием хранившейся и вновь приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител в МР с обеими антигенными эмульсиями, то считают, что снижение реактивности зависит от хранения контрольной сыворотки крови, если же снижение реактивности наблюдают только при использовании хранившейся эмульсии антигена, то это обусловлено снижением реактивности эмульсии антигена, которую необходимо заменить свежеприготовленной.

Серологические лаборатории кожно-венерологических диспансеров должны снабжать контрольными сыворотками крови лаборатории района, использующие в своей работе экспресс-метод и не имеющие положительных и отрицательных сывороток крови. При отсутствии контрольных сывороток крови реакцию ставить нельзя.

Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации, выпускаемого Харьковским предприятием по производству бактерийных препаратов Министерства здравоохранения СССР. Нельзя использовать в микрореакции кардиолипиновый антиген, предназначенный для реакции связывания комплемента.

Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность ампулированного антигена. При выпадении кристаллов холестерина, их растворяют нагреванием ампул в термостате или водяной бане при 37° или 56° соответственно.

Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают необходимое количество ее на рабочий день или рабочую неделю (на 50 исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку вносят сухой пипеткой не более 2 мл антигена, добавляя его к равному объему 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем центрифугируют при 1000 об/мин до получения прозрачной надосадочной жидкости, которую удаляют, а к осадку добавляют 3, 5 объема (по отношению к взятому антигену) 10% раствора холин-хлорида. Например, если требуемый объем антигена равен 0,5 мл, то для вычисления количества холин-хлорида 0,5 мл умножают на 3,5 и получают 1,75 мл, т.е. необходимый объем холин-хлорида. Пробирку плотно закрывают пробкой и содержимое взбалтывают, опрокидывая пробирку, до полного ресусиендирования. Полученная эмульсия готова к употреблению. При необходимости приготовления большого количества эмульсии, ее готовят не в одном флаконе большой емкости, а в нескольких пробирках, внося в каждую из них по 2 мл антигена. Такие объемы обеспечивают лучшее перемешивание антигена, предохраняют его от загрязнения при повторном взятии для постановки реакции, а также от нагревания и действия солнечных лучей.

Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4° не более недели, а при добавлении раствора мертиолата - в течение 2 недель. В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 минут и проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови. Применяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой серии антигена проверяют в экспресс-методе одновременно с уже бывшей в работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови. О пригодности антигена судят по величине титров, наблюдаемых при одновременном титровании положительных сывороток крови с новой и проверенной сериями антигенов. Получение близких результатов, т.е. величин титров реагинов, отличающихся на ё1 разведение, одинаковой выраженности хлопьев преципитата, наблюдаемых в одних и тех же разведениях положительных сывороток крови, а также отсутствие преципитата в отрицательной сыворотке крови свидетельствует о пригодности исследуемой серии антигена. Серию антигена бракуют, если одновременное титрование контрольной положительной сыворотки крови с новой серией антигена показывает: а) слабо выраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях сыворотки крови, б) более низкий (на 2 - 3 разведения) титр реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией, в) наличие преципитата в отрицательных сыворотках крови.

Получение плазмы крови

Кровь берут из пальца так же, как для исследования скорости оседания эритроцитов (СОЭ). При взятии крови смачивают капилляр аппарата Панченкова 5% раствором цитрата натрия, набрав раствор до метки "К", возвращают во флакон раствор до метки "25", а оставшийся цитрат натрия выливают в центрифужную пробирку, куда затем вносят три капилляра крови, взятой до метки "К", перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы крови, которую отсасывают пастеровской пипеткой для проведения исследования.

Получение инактивированной сыворотки крови

Кровь берут из вены, получают сыворотку крови и инактивируют ее так же, как для РСК.

Методика постановки микрореакции с плазмой и инактивированной сывороткой крови

Пастеровской пипеткой насасывают плазму или инактивированную сыворотку крови и вносят по три капли в лунки, куда затем добавляют одну каплю эмульсии кардиолипинового антигена. В каждую лунку вносят плазму или инактивированную сыворотку крови от одного обследуемого и нумеруют ее соответственно списку в регистрационном журнале. Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины в течение 5 минут, затем в каждую лунку добавляют по три капли изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28°). Результаты учитывают только после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке крови.

Оценка результатов реакции

Результаты учитывают невооруженным глазом над искусственным источником освещения. В лунках с плазмой или сывороткой крови, взятых от больных сифилисом, выпадают различной величины хлопья. Появление крупных хлопьев расценивают как положительный результат (4+, 3+), средней величины и мелких - как слабоположительный результат (2+, 1+). При отрицательном результате хлопья не образуются. В сомнительном случае (+/-) необходимо ориентироваться на контроль отрицательной сыворотки крови. Если в нем хлопья отсутствуют, а в образцах плазмы или сыворотки крови обследуемых лиц образуются мелкие хлопья, результат в этом случае расценивают как сомнительный (+/-) и исследование повторяют по количественному методу, так как может наблюдаться феномен прозоны, когда в неразведенной сыворотке крови видимый преципитат отсутствует, а в ее разведениях он появляется. Количественная методика применяется также для суждения о концентрации антител в крови больного в процессе и после лечения.

Количественная методика постановки микрореакции

В девять лунок горизонтального ряда пластины, начиная со второй лунки, вносят по три капли изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по три капли исследуемой сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пастеровской пипеткой, насасывая его в пипетку и выпуская из нее в лунку 5-6 раз, затем часть содержимого набирают в пипетку и три капли переносят в третью лунку, а оставшееся в пипетке возвращают во вторую лунку. Из третьей лунки три капли переносят в четвертую и т.д. до десятой лунки, из которой три капли удаляют. Таким образом, получают двухкратные разведения сыворотки крови 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 и далее до 1 : 516. В первую лунку изотонический раствор натрия хлорида не приливают, а вносят только три капли сыворотки крови, т.е. исследуют цельную сыворотку крови. Во все лунки добавляют по одной капле эмульсии кардиолипинового антигена. Пластину встряхивают 5 минут, после чего во все лунки вносят по три капли изотонического раствора натрия хлорида. Через 5 минут регистрируют результаты так же, как при постановке качественной методики.

Источники ошибок

Неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха в капилляре пипеток).

Исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабоположительных.

Неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием.

Бактериальное загрязнение эмульсии.

Нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсин, растворов.

Замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным.

Использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, пластинок, растворов.

Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.