Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава СССР от 02.09.85 N 1161 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА" (вместе с "ИНСТРУКЦИЕЙ ПО ПОСТАНОВКЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА СИФИЛИС")

Ингредиенты

Испытуемая сыворотка крови

Кровь для получения сыворотки крови берут из локтевой вены в чистую и сухую пробирку в объеме 5 мл и обрабатывают также, как для постановки реакции Вассермана. Инактивируют сыворотки крови однократно при температуре 56° в течение 30 минут. В связи с тем, что РИФ-абс ставится нестерильно, использование стерильной посуды и соблюдение условий стерильности при хранении сывороток крови не обязательно. Оно имеет значение только для более длительного сохранения сывороток крови до исследования.

Антиген

В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-суточного орхита кролика. Здоровых кроликов-самцов с отрицательными результатами реакции Вассермана и РИТ заражают интратестикулярно и при возникновении орхита извлекают из яичек бледные трепонемы так же, как в случае получения антигена для РИТ. Полученную взвесь бледных трепонем сливают с кусочков яичка в стерильные пробирки с ватными пробками и оставляют в холодильнике при 4° на сутки, после чего отделяют от осадка и при тех же условиях сохраняют весь период использования.

Получение и хранение антигена требует соблюдения условий стерильности, т.к. с одним и тем же антигеном реакция может ставиться в течение 2-4 месяцев. Для антигена следует выбирать ту взвесь, в которой не наблюдается агглютинация трепонем и имеется достаточное их количество. Антиген может быть получен в ампулах из других лабораторий. Перед каждой постановкой реакции взвесь хорошо перемешивают и исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения для определения ее густоты. Для постановки РИФ-абс необходимо иметь взвесь, содержащую 40-60 трепонем в темном поле зрения, при наличии более густой взвеси ее необходимо развести.

Сорбент

В качестве сорбента для РИФ-абс может быть использован ультраозвученный трепонемный антиген для РСК, выпускаемый Каунасским предприятием по производству бактерийных препаратов Минздрава СССР. Он представляет собой разрушенную ультразвуком взвесь смеси культуральных бледных трепонем штаммов V, VII, VIII, IX и Рейтера. Каждая серия сорбента перед использованием в РИФ-абс с диагностической целью должна быть оттитрована.

Титрование сорбентов

Сорбенты титруют на сыворотках крови больных сифилисом, дающий в РИФ резко (4+) и слабо (2+) положительный результат в разведении 1 : 5, а также на сыворотках крови лиц, свободных от сифилитической инфекции, дающих в РИФ-5 отрицательный результат и неспецифическую позитивность (2+ и более).

Пример определения титра сорбента

Цельный сорбент разводят фосфатным буфером, РН = 7,2, в 2, 3, 4 раза и более. Берут 3 сыворотки крови от больных сифилисом, одна из которых дает в РИФ-5 резкоположительный (4+) результат, 2 - слабоположительный (2+), и 5 сывороток крови от людей, свободных от сифилитической инфекции, 3 из которых дают неспецифические результаты и РИФ-5 (2+ и более). Все сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным в свою очередь в 2, 3, 4 и более раз фосфатным буфером. Затем сыворотки крови исследуют в реакции. После учета результатов выбирают разведение сорбента, при котором сорбированные сыворотки крови больных сифилисом сохраняют степень позитивности, аналогичную полученной с сыворотками крови, разведенными фосфатным буфером, а сыворотки крови лиц, свободных от сифилитической инфекции, не дают свечения. Это разведение сорбента является его титром.

Титром сорбента в данном случае явилось разведение 1 : 3, при котором все сыворотки крови больных сифилисом сохраняли степень позитивности, полученную в контроле, и в то же время надежно снималась неспецифическая позитивность несифилитических сывороток крови.

Антивидовая люминесцирующая сыворотка

Для исследования в РИФ-абс сывороток крови людей необходима меченная флюорохромом сыворотка крови животных, иммунизированных сывороточным белком человека. Лиофильно высушенную люминесцирующую сыворотку растворяют при соблюдении условий стерильности в дистиллированной воде в том объеме, который указан на этикетке ампул, переливают в стерильную пробирку с резиновой пробкой и в процессе использования хранят при 4° в течение 1-2 месяцев.

В день постановки реакции нужное количество этой сыворотки разводят по титру дистиллированной водой. Указанное на этикетке рабочее разведение сыворотки не годится для постановки реакции с целью серодиагностики сифилиса, поэтому титр каждой серии необходимо определять заново.

Таблица N 13

Результаты титрования сорбента

Титрование антивидовой люминесцирующей сыворотки

Берут 5 сывороток крови больных сифилисом и 5 сывороток крови здоровых людей, разводят их в 5 раз сорбентом (с учетом его титра) и ставят реакцию с использованием во II фазе различных разведений люминесцирующей сыворотки против сывороточных глобулинов человека той серии, титр которой определяется. Следует учесть, что титр люминесцирующих сывороток, выпускаемых в настоящее время ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, колеблется при постановке РИФ-абс от 1 : 100 до 1 : 140. При учете реакции предварительным титром люминесцирующей сыворотки следует считать то разведение, при использовании которого с положительными сыворотками крови получено хорошее свечение трепонем, а с отрицательными свечение антигена не получено. Большее разведение люминесцирующей сыворотки, чем титр, приводит к понижению чувствительности реакции, а меньшее - к снижению специфичности. После определения предварительного титра следует его уточнить на большем числе положительных и отрицательных сывороток крови. Окончательным титром можно считать тот, который проверен на 100 сыворотках крови, причем из них не менее 20 должно быть от больных сифилисом.

Для предотвращения пророста после разведения сухой люминесцирующей сыворотки дистиллированной водой к ней необходимо добавить мортиолат из расчета 1 объема его раствора 1 : 1000 к 9 объемам люминесцирующей сыворотки. При взятии новых ампул той же серии титр следует только проверить и уточнить на 10 заведомо положительных и отрицательных сывороток крови.

Пример определения предварительного титра люминесцирующей антивидовой сыворотки

Готовят 60 препаратов, нумеруют их от 1 до 60. Берут 10 сывороток крови - 5 от больных сифилисом, 5 от здоровых людей. Все сыворотки крови разводят в 5 раз разведенным но титру сорбентом.

На пронумерованные 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60 препараты наносят в I фазе реакции одни и те же 10 сывороток крови, разведенных в 5 раз сорбентом. Во II фазе реакции на 1-10 препараты наносят люминесцирующую сыворотку, разведенную 1 : 100, на 11-20 1 : 110, на 21-30 - 1 : 120, на 31-40 - 1 : 130, на 41-50 - 1 : 140, на 51-60 - 1 : 150.

Оптимальным следует считать разведение, при котором свечение антигена будет хорошим при постановке реакции с положительными сыворотками крови и не будет наблюдаться с отрицательными.

Техника постановки РИФ-абс

Из антигена готовят препараты на тонких, хорошо обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых стеклорезом обозначены кружки диаметром 0,7 см (по 10 кружков на 1 предметном стекле). В пределах кружка на стекло наносят антиген-взвесь бледных трепонем. Запаянным концом пастеровской пипетки круговыми движениями взвесь распределяют в пределах кружка, высушивают на воздухе и фиксируют 10 минут в химически чистом ацетоне. Затем препараты нумеруют. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным по титру буферным раствором. В штатив помещают ряд пробирок, число и номер которых соответствует числу и номеру испытуемых сывороток крови. В пробирки пипеткой разливают разведенный по титру сорбент по 0,2 мл, затем добавляют по 0,05 мл цельной испытуемой сыворотки крови и хорошо перемешивают. Разведение сыворотки крови можно осуществлять аппаратом Флоринского. Разведенные сорбентом сыворотки крови наносят на антиген так, чтобы равномерно покрыть мазок, и препараты помещают во влажную камеру, которую закрывают крышкой и помещают на 30 минут в термостат при 37° (I фаза реакции). После первой фазы препараты осторожно промывают в 2 порциях фосфатного буфера, причем во вторую порцию препараты помещают на 10 минут, высушивают, после чего их вновь помещают во влажную камеру, наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку и оставляют при комнатной температуре на 30 минут (II фаза реакции). По окончании второй фазы препараты промывают фосфатным буфером, как описано выше, высушивают и наносят на поверхность мазков по капле нелюминесцирующего иммерсионного масла (диметилфталата).

Исследование препаратов производят в люминесцентном микроскопе с ртутно-кварцевой лампой ДРШ-250 с иммерсионной системой, окуляром 4Х или 5X, фильтрами СЗС-7 или 14, ФС-1. БС-8 и ЖС-18 или Т-2Н. Учет реакции осуществляется путем оценки свечения бледных трепонем. Положительными в РИФ-абс считают сыворотки крови, которые дают свечение на 4+, 3+ и 2+. Блестящее зелено-желтое свечение оценивается на 4+, яркое - 3+, слабое свечение2+. Отрицательными считают сыворотки крови, которые дают свечение на 1+ (трепонемы в препарате окрашены интенсивнее фона) или не дают его.

В каждой постановке РИФ-абс необходимо использовать следующие контроли:

Резкоположительный контроль. Сыворотка крови больного сифилисом, дающая свечение на 4+ при разведении буфером в 5 раз. При разведении в 5 раз сорбентом сыворотка крови не должна терять степень позитивности более, чем на 1+.

Слабоположительный контроль. Цельная или разведенная сыворотка крови больного сифилисом, дающая слабую степень свечения антигена на 2+ при разведении буфером в 5 раз. При разведении сорбентом позитивность ее должна сохраняться.

Неспецифический контроль. Несифилитическая сыворотка крови, дающая при разведении буфером флюоресценцию не менее 2+. При разведении сорбентом позитивность ее должна быть ликвидирована.

Контроли антигена, сорбента, люминесцирующей сыворотки могут ставиться только при использовании новых серий этих ингредиентов.

Методика постановки РИФ-абс с капиллярной кровью

Постановка РИФ-абс возможна не только с сывороткой крови, но и с кровью, взятой из пальца. Эту модификацию РИФ-абс можно использовать при обследовании на сифилис детей, при трудности получения крови из вены у взрослых, при массовом обследовании различных контингентов на сифилис.

При постановке РИФ-абс с кровью применяют те же ингредиенты реакции, что и при постановке РИФ-абс с сывороткой крови (антиген, сорбент, люминесцирующая сыворотка). Титр люминесцирующей сыворотки определяют по вышеизложенной схеме, но при постановке реакции с кровью. Кровь для исследования после прокола пальца пациента набирают микропипеткой до метки 0,1 мл, быстро выдувают в пробирку, содержащую 0,3 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают пипеткой и фильтруют через бумажный фильтр, смоченный дистиллированной водой. Постановка реакции с разведенной кровью возможна как в день взятия ее, так и через 1-2 дня при условии хранения при 4°.

Непосредственно перед постановкой реакции ко всем образцам крови, включенным в постановку реакции, добавляют по 0,1 мл цельного сорбента, перемешивают пипеткой и встряхиванием, помещают на 30 минут в термостат при 37°. Затем кровь, обработанную сорбентом, наносят на мазки антигена и помещают ее во влажную камеру при 37° (1 фаза реакции). По истечении срока экспозиции препараты промывают в первой порции фосфатного буфера так, чтобы на стеклах не осталось следов крови и помещают их на 10 минут во вторую порцию буфера. После высушивания мазков проводят II фазу реакции. При этом на препараты наносят разведенную по титру, установленному для данной модификации РИФ, люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека. Стекла во влажной камере вновь помещают в термостат при 37°.

Через 30 минут препараты вновь промывают в 2 порциях фосфатного буфера в течение 10 минут, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии. Исследование препаратов и учет результатов реакции проводят так же, как при постановке РИФ-абс с сывороткой крови.

Методика постановки РИФ-200

Методика постановки РИФ-абс и РИФ-200 близки. При постановке РИФ-200 обработка испытуемых сывороток крови, приготовление антигена, подготовка антивидовой люминесцирующей сыворотки и ее титрование производят так же, как при постановке РИФ-абс. Следует учесть только, что титры люминесцирующей сыворотки, выпускаемой в настоящее время, в РИФ-200 колеблются от 1 : 20 до 1 : 50.

Техника постановки РИФ-200

Испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз фосфатным буфером. Для этого в штатив помещают 3 ряда пробирок, число и нумерация которых в каждом ряду соответствует числу и нумерации испытуемых сывороток крови в рабочем журнале. В первом ряду налиты цельные испытуемые сыворотки крови, во втором ряду в пробирки наливают по 0,45 мл буфера, в третьем - по 0,95 мл буфера. Во втором ряду готовят разведение сывороток крови в 10 раз, для чего из каждой пробирки первого ряда отдельной 1 мл градуированной пипеткой берут 0,05 мл испытуемой сыворотки крови, переносят в соответствующую пробирку второго ряда и смешивают с имеющимся там буфером. Из каждой пробирки второго ряда той же самой пипеткой переносят по 0,05 мл разведенной уже в 10 раз испытуемой сыворотки крови в соответствующую пробирку третьего ряда и получают разведение в 200 раз.

При постановке реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят разведенные в 200 раз испытуемые сыворотки крови так, чтобы их номера, обозначенные на пробирках, соответствовали номерам на предметных стеклах. После нанесения на препараты сыворотки крови влажную камеру помещают на 30 минут в термостат с температурой 37° (I фаза реакции). Затем препараты промывают 10 минут в 2 порциях буфера и высушивают. После этого их вновь помещают во влажную камеру и на все наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку (II фаза реакции). Вторую фазу проводят 30 минут при комнатной температуре, после чего препараты 10 минут промывают, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии.

Учет результатов РИФ-200 производят так же, как и РИФ-абс.

В том случае, когда клиницистов интересует титр флюоресцирующих антител в сыворотке крови больного, РИФ-абс и РИФ-200 следует ставить с последовательным разведением испытуемых сывороток крови и титром флюоресцирующих антител считать то наибольшее разведение сыворотки крови, которое еще дает положительный результат реакции. Обозначать титр принято числом, характеризующим степень разведения испытуемой сыворотки крови, например, 5, 10, 20, 40 и т.д. (РИФ-абс) или 200, 400, 800 и т.д. (РИФ-200).

При постановке обеих модификаций реакции для разведения испытуемых сывороток крови и для промывания препаратов после I и II фаз следует использовать фотфатный буфер следующего состава: 1 л дистиллированной воды, 6,8 г натрия хлорида, 1,48 г двузамещенного фосфорно-кислого натрия, 0,43 г однозамещенного фосфорнокислого калия (РН = 7,2). Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более недели.

В связи с возможностью получения отрицательных результатов при наличии флюоресцирующих антител не следует исследовать кровь и сыворотку крови в РИФ-абс и РИФ-200 во время лечения больных пенициллином.

Методика постановки РИФ-ц

Ранняя диагностика поражений нервной системы при сифилисе является актуальным вопросом в деле борьбы с этим заболеванием. В связи с тем, что РИФ-ц обладает большей чувствительностью, чем все другие используемые для ликвордиагностики сифилиса тесты, эта модификация РИФ может быть рекомендована для диагностики сифилитических поражений центральной нервной системы при всех формах сифилиса.

Для постановки РИФ-ц используют тот же антиген, люминесцирующую сыворотку, что и для постановки РИФ-абс и РИФ-200 с сывороткой крови. Аналогичны также определение флюоресцирующих антител в ликворе и сыворотке крови и учет реакции.

Спинномозговая жидкость вводится в реакцию неинактивированной и цельной. До постановки реакции ее можно сохранять в морозильном отделении холодильника в пробирках под резиновыми пробками до 2 недель. Оттаивание производят при комнатной температуре.

Техника постановки РИФ-ц

В I фазе реакции на антиген наносят 0,05 мл неразведенной испытуемой спинномозговой жидкости, препараты помещают во влажную камеру на 30 минут при комнатной температуре. Затем их промывают фосфатным буфером, РН = 7,2, в течение 10 минут, высушивают. Во II фазе на препараты наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку, которую титруют при постановке реакции со спинномозговой жидкостью. Выдерживают препараты при комнатной температуре 30 минут во влажной камере, промывают, высушивают, монтируют для люминесцентной микроскопии.

Источники ошибок

1. Несоблюдение условий приготовления, хранения реагентов и постановки реакции.

2. Низкое качество люминесцирующей сыворотки и неточное определение ее титра.

3. Нанесение исследуемого материала или люминесцирующей сыворотки при постановке реакции не на препарат, а на другую сторону предметного стекла.

4. Неправильная установка освещения в люминесцентном микроскопе.

5. Низкое качество антигена.