Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава СССР от 02.09.85 N 1161 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА" (вместе с "ИНСТРУКЦИЕЙ ПО ПОСТАНОВКЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА СИФИЛИС")

Принцип

Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с кардиолипиновым антигеном. Специфические антитрепонемные антитела вступают в соединение со специфическими антигенами (ультраозвученный трепонемный антиген). Образовавшиеся комплексы антиген-антитело сорбирует вводимый в реакцию, комплемент. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (гемолитическая сыворотка + эритроциты барана).

Оборудование

Термостат с температурой 37°.

Холодильник с температурой 4°.

Инактиватор (водяная или суховоздушная баня) с температурой 56°. Центрифуга.

Пробирки размером 14 x 60 мм, 15 x 100 мм, 15 x 150 мм

Пипетки градуированные 1, 2 мл с делениями на 0,01 мл

Пипетки градуированные 5, 10 мл с делениями на 0,1 мл

Цилиндры мерные емкостью 100, 250, -500, 1000 мл с делениями на 5 мл.

Стаканы химические, емкостью 100, 250, 500 мл.

Приборы дозировочные для серологических исследований (Флоринского) - ФЛ-3 и ФЛ-4.

Ингредиенты:

0,9% изотонический раствор натрия хлорида.

Испытуемая сыворотка крови.

Взятие крови производят натощак или не ранее 6 часов после приема пищи. Нельзя брать кровь у больных с повышенной температурой, после употребления спиртных напитков ранее 24 часов, перенесших недавно инфекционное заболевание, у женщин во время менструации, беременных в последние 10 дней беременности, рожениц в первые 10 дней после родов, новорожденных в первые 10 дней жизни.

Кровь из локтевой вены в количестве 7 - 10 мл берут в сухую чистую пробирку. Пункцию производят стерильной иглой при соблюдении правил асептики. У грудных детей кровь берут из надреза пятки узким скальпелем.

В лабораторию кровь должна быть доставлена не позднее 48 часов с момента взятия при условии ее хранения в холодильнике при 4°.

Сыворотка крови может быть использована для постановки реакции в день взятия крови.

Доставленную в лабораторию кровь в день ее взятия помещают в термостат при 37° на 15-30 минут. Образовавшийся сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки и центрифугируют 15 минут при 1000 об/мин. Над сгустком образуется прозрачная сыворотка крови, которую при помощи пипетки с резиновым баллоном без примеси эритроцитов переносят в другую пробирку. При наличии в сыворотке крови примеси эритроцитов ее центрифугируют и отделяют от них. Кровь, доставленную в лабораторию накануне постановки реакции, отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки и помещают в холодильник при 4°. Перед постановкой реакции образовавшуюся над сгустком крови сыворотку переносят в другую пробирку.

Снятую со сгустка сыворотку крови инактивируют в суховоздушном инактиваторе или водяной бане в течение 30 минут при 56° для уничтожения естественного комплемента и стабилизации глобулиновых фракций испытуемой сыворотки крови.

Инактивированные сыворотки крови могут храниться в холодильнике в течение 5-6 дней. Сыворотки крови, ранее инактивированные, в день постановки реакции должны быть повторно прогреты в течение 15 минут при 56°. Для более длительного хранения к сыворотке крови после инактивации добавляют сухую борную кислоту (из расчета 2%), что позволяет ею пользоваться в течение 3-4 недель, или замораживают в морозильной камере холодильника на тот же срок, не допуская повторного замораживания и оттаивания.

В случаях, если нельзя немедленно доставить кровь для исследования в лабораторию, можно пользоваться высушенной сывороткой крови. Для этого 2 мл сыворотки крови без примеси эритроцитов наносят на сложенную вдвое вощаную бумагу, целлофан (8 x 10 см) в виде четырех кружочков по 0,5 мл в каждом. К сыворотке крови добавляют по 3 капли свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара на каждые 0,5 мл сыворотки. Предварительно на вощаной бумаге, целлофане надписывают фамилию, имя, отчество, дату взятия крови и объем нанесенной сыворотки крови, которую высушивают при комнатной температуре. Затем вощаную бумагу, целлофан тщательно свертывают в виде аптечного пакетика и в конверте по почте отправляют в ближайшую серологическую лабораторию. Такие сыворотки крови должны быть исследованы не позднее 5 дней с момента взятия крови в южных районах страны, а также в летнее время года, и не позднее 10 дней на остальных территориях страны.

В лаборатории полученную высушенную сыворотку крови ссыпают в пробирку. Для ее растворения добавляют изотонический раствор натрия хлорида, восстанавливая первоначальный объем сыворотки крови. Сыворотка крови растворяется в течение одного часа стояния при комнатной температуре. Затем ее инактивируют при 56° в течение 30 минут, после чего она может быть использована для постановки реакции.

Желтушные, хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки крови для исследования не пригодны.

Антигены

Реакция Вассермана должна ставиться с двумя антигенами: ультраозвученным трепонемным и кардиолипиновым.

Ультраозвученный трепонемный антиген приготовлен из культур бледных трепонем, подвергнутых действию ультразвука.

Ультраозвученный трепонемный антиген выпускают лиофильно высушенным во флаконах по 5 и 10 мл; хранят его в холодильнике при 4°. Срок годности антигена указан на этикетке. Антиген растворяют и разводят изотоническим раствором натрия хлорида соответственно объему и титру, указанному на этикетке флакона.

Кардиолипиновый антиген для реакции Вассермана представляет собой очищенный от балластных примесей спиртовый экстракт липидов из мышц бычьего сердца. Активность антигена обусловливается присутствием трех компонентов - фосфолипида, лецитина и холестерина.

Кардиолипиновый антиген выпускается в ампулах 2 мл; хранят его в темном месте при 15 - 18°. Срок годности антигена указан на этикетке.

Перед употреблением антиген из ампулы переносят в сухую чистую пробирку, плотно закрывают корковой или притертой стеклянной пробкой.

В случае выпадения кристаллов холестерина антиген необходимо прогреть на водяной бане при 56° или в термостате при 37° до полного растворения кристаллов.

Для постановки реакции антиген разводят соответственно титру, указанному на этикетке ампулы. Разведенный антиген должен быть слегка опалесцирующим, но не мутным.

Титр - это количество чистого антигена в 1 мл раствора. Например, если титр ультраозвученного трепонемного антигена 0,05, то для приготовления 10 мл разведенного по титру антигена нужно взять 0,5 мл антигена и 9,5 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Двойные дозы антигенов не должны обладать гемотоксичностью (гемолиз в отсутствии комплемента), что устанавливается соответствующим контролем антигена при титровании комплемента. Антигены не должны быть антикомилементарными (подавление гемолиза), что также устанавливают при параллельном титровании комплемента без генов и в присутствии антигенов, применяемых в реакции связывания комплемента.

Гемолитическая сыворотка (гемолизин)

Это сыворотка крови кролика или осла, иммунизированных эритроцитами барана.

Гемолитическая сыворотка (жидкая или сухая) выпускается в ампулах по 1 мл с указанием титра. Для растворения сухого гемолизина в ампулу добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Гемолитическая сыворотка как сухая, так и растворенная хранится в холодильнике при 4°. Срок годности сухой гемолитической сыворотки указан на этикетке.

Титр используемой гемолитической сыворотки не должен быть ниже 1 : 1200. Определение титра производят по следующей схеме: готовят основное разведение 1 : 100 (0,1 мл гемолитической сыворотки + 9,9 мл изотонического раствора натрия хлорида), из которого делают ряд соответствующих разведений (таблица N 1).

Таблица N 1

Схема разведений гемолизина

Затем в ряд других пробирок отмеряют по 0,5 мл ранее приготовленных разведении гемолитической сыворотки, начиная с 1 : 1000, добавляют по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,5 мл комплемента (комплемент в разведении 1 : 10), а также 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана (таблица N 2); пробирки помещают в термостат при 37° на 1 час, периодически встряхивая 2-3 раза.

Титром гемолитической сыворотки является наивысшее ее разведение, давшее полное растворение 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента. В данном случае титр гемолитической сыворотки - 1 : 1500 (таблица N 2).

Для основного опыта и титрования ингредиентов берут разведение, усиленное против полученного титра в три раза (тройной титр). В данном примере - 1 : 500 (0,1 на 50).

Таблица N 2

Определение титра гемолизина

Эритроциты барана

Баран должен быть в возрасте от 1 до 5 лет. Кровь у него берут путем пункции яремной вены не чаще 1 раза в 10 дней, в количестве не более 200 мл в сухую стерильную банку со стеклянными бусами, которую встряхивают в течение 5-10 минут. Затем кровь фильтруют через двойной слой марли (отделяют образовавшиеся сгустки нитей фибрина).

В день постановки реакции эритроциты барана трех - пятикратно отмывают изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования. Центрифугируют 10 минут при 1,5 тысячах оборотов в минуту. Последнюю бесцветную порцию промывной жидкости сливают, а осадок вновь центрифугируют для его уплотнения. Надосадочную жидкость вновь удаляют, а из плотного осадка готовят 3% взвесь эритроцитов барана в изотоническом растворе натрия хлорида (на 3 мл плотного осадка эритроцитов добавляют 97 мл изотонического раствора натрия хлорида). Отмытые эритроциты в последующие дни в работе не используют. При наличии гемолиза эритроциты барана к употреблению не пригодны.

Дефибринированную кровь сохраняют в широкогорлом сосуде, накрытом стерильной двухслойной марлевой салфеткой в течение 5-7 дней в холодильнике при 4°.

Для хранения дефибринированной крови барана длительное время рекомендуется консервировать ее по методу Мигулиной. Для этого к 100 мл дефибринированной крови барана добавляют 15 мл смеси, приготовленной по следующей прописи: глюкозы - 6,0 г, борной кислоты - 4,5 г, 100 мл изотонического раствора натрия хлорида; приготовленную смесь кипятят на водяной бане 3 дня подряд по 20 минут. Консервированная кровь барана по методу Мигулиной годна к употреблению в течение 3-4 недель. Перед постановкой реакции при использовании консервированной крови эритроциты необходимо отмывать изотоническим раствором натрия хлорида так же, как неконсервированной.

Комплемент

Применяют смесь сыворотки крови, полученной пункцией сердца у 5-10 здоровых морских свинок. Кровь для лучшего свертывания помещают в термостат при 37° на 30 минут. После образования сгустка последний отделяют от стенок пробирки, которую помещают в холодильник при 4° до следующего дня. Полученную прозрачную сыворотку крови сливают и используют как комплемент. Активность этого комплемента при хранении в холодильнике при 4° сохраняется в течение 1-2 суток.

При консервировании сухой борной кислотой и сернокислым натрием комплемент сохраняется в холодильнике при 4° 1-2 месяца (4,0 г борной кислоты + 0,5 г сернокислого натрия на 100 мл комплемента).

Может быть использован лиофильно высушенный комплемент. Сухой комплемент выпускается в ампулах по 1 мл.

Растворение сухого комплемента производят в день постановки реакции изотоническим раствором натрия хлорида при легком встряхивании. В ампулу с сухим комплементом добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Нужное для постановки реакции количество комплемента смешивают из нескольких ампул одной серии.

Непосредственно перед постановкой реакции Вассермана проводят титрование комплементы в присутствии всех ингредиентов, участвующих в опыте.

Комплемент титруют обязательно: а) в чистом виде (без антигенов), т.е. в присутствии только гемолитической системы и б) с каждым антигеном, входящим в опыт. Титрование комплемента проводят также в присутствии инактивированной отрицательной сыворотки крови человека.

При титровании комплемента ингредиенты разводят в следующем порядке:

1. Разводят гемолитическую сыворотку по утроенному титру в изотоническом растворе натрия хлорида.

2. Из плотного осадка эритроцитов готовят 3% взвесь в изотоническом растворе натрия хлорида.

3. Разливают 3% взвесь эритроцитов барана и изотонический раствор натрия хлорида в 5 контрольных пробирок и разведенную по утроенному титру гемолитическую сыворотку (во второй контроль) - таблица N 3.

4. Готовят гемолитическую систему: раствор гемолитической сыворотки, разведенной по утроенному титру, приливают к равному объему 3% взвеси эритроцитов барана и производят быстрое смешивание путем переливания из одной колбы в другую.

Полученную смесь помещают в термостат при 37° на 30 минут для сенсибилизации эритроцитов.

5. Разводят антигены изотоническим раствором натрия хлорида по указанному на этикетке титру.

6. Разводят заведомо отрицательную инактивированную сыворотку крови человека в соотношении 1 : 5 (2 мл сыворотки крови + 8 мл изотонического раствора натрия хлорида).

7. Разводят комплемент 1 : 10 (1 мл комплемента + 9 мл изотонического раствора натрия хлорида).

Титрование комплемента в объеме 1,25 мл

Таблица N 3

Схема проведения контроля

Титрование комплемента проводят в 30 пробирках, поставленных по 10 штук в три ряда. Два ряда пробирок для титрования комплемента в присутствии двух антигенов и третий ряд - для титрования комплемента без антигенов. Пять контрольных пробирок: две - для контроля антигенов и по одной - для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и изотонического раствора натрия хлорида на гемотоксичность - заполняют до объединения раствора гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов барана (таблица N 3).

Комплемент, разведенный 1 : 10, разливают в 10 пробирок первого ряда в дозах: 0,1; 0,16; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44; 0,5; 0,55 мл (таблица N 4).

Таблица N 4

Титрование комплемента в присутствии антигена и
отрицательной сыворотки крови человека

Общий объем содержимого пробирок доводят до 1 мл соответствующими объемами изотонического раствора натрия хлорида: 0,9; 0,84; 0,8; 0,76; 0,7; 0,64; 0,6; 0,56; 0,5; 0,45 мл.

Полученную в каждой пробирке смесь тщательно перемешивают и переносят по 0,25 мл в соответственно стоящие позади два ряда пробирок и 0,25 мл выливают. Затем во все 30 пробирок разливают по 0,25 мл инактивированной отрицательной сыворотки крови человека, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 5. Далее в 10 пробирок первого ряда приливают по 0,25 мл разведенного по титру трепонемного антигена; разведенный по титру кардиолипиновый антиген приливают по 0,25 мл в 10 пробирок второго ряда; изотонический раствор натрия хлорида приливают по 0,25 мл в 10 пробирок третьего ряда.

Штатив с пробирками встряхивают и добавляют по 0,5 мл гемолитической системы в третий ряд пробирок (без антигенов). Штатив с пробирками вновь встряхивают и помещают на 45 минут в термостат при 37°. После инкубации в термостате в 20 пробирок первого и второго рядов добавляют по 0,5 мл гемолитической системы. Содержимое пробирок вновь встряхивают и помещают в термостат при 37° на 45 минут. По истечении 45 минут определяют рабочую дозу комплемента, которая устанавливается следующим образом: в основу берут титр комплемента без антигенов, затем титр комплемента в присутствии антигенов, к которому делают надбавку в пределах 15-30% (в среднем 20%) в зависимости от степени гемолиза в пробирках с меньшим количеством комплемента (таблица N 4).

Титром комплемента является наименьшее его количество, способствующее полному гемолизу эритроцитов барана в присутствии антигена и отрицательной сыворотки крови человека.

В данном случае титр комплемента будет 0,3, а рабочая доза комплемента - 0,36, т.е. 3,6%.

Для каждого рабочего дня готовят необходимый объем комплемента, разведенного по рабочей дозе, исходя из расчета 0,75 мл комплемента на каждую испытуемую сыворотку крови при условии постановки реакции Вассермана с двумя антигенами. Так, на 100 испытуемых сывороток крови необходимо 75 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Следовательно, к 72,3 мл изотонического раствора натрия хлориды нужно прибавить 2,7 мл комплемента.

В случае получения разных титров комплемента в присутствии трепонемного и кардиолипинового антигенов используют разные рабочие дозы комплемента в соответствии с полученными титрами.

Качественная методика постановки реакции Вассермана

В день постановки опыта проводят подготовительную работу (сливание испытуемых сывороток крови со сгустка, их инактивация, отмывание эритроцитов барана от плазмы крови, приготовление изотонического раствора натрия хлорида).

Разводят ингредиенты: гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, антигены по титру. Определяют рабочую дозу комплемента титрованием без антигенов, в присутствии антигенов.

Расход ингредиентов на 100 исследований

Исследование каждой испытуемой сыворотки крови проводят в трех пробирках с двумя антигенами (таблица N 5). Одновременно исследуют для контроля заведомо положительные (4+, 2+) и отрицательную сыворотки крови. Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1 : 5 изотоническим раствором натрия хлорида, разливают по 0,25 мл в три пробирки, из которых третья является контрольной. В первую пробирку добавляют 0,25 мл трепонемного антигена, во вторую - 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенных по титру. В третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Комплемент, разведенный по рабочей дозе, добавляют по 0,25 мл во все опытные и контрольные пробирки. Предварительное смешивание антигена и комплемента не рекомендуется. После первичной 45-минутной инкубации в термостате при 37° добавляют во все пробирки по 0,5 мл гемолитической системы. Легким встряхиванием перемешивают содержимое пробирок и помещают их в термостат при 37° на 45-50 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке. Регистрируют результат реакции по наличию или отсутствию гемолиза в опытных пробирках.

Оценка результатов

Для обозначения степени позитивности реакции Вассермана пользуются системой четырех плюсов:

полная задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - 2+ (слабоположительная реакция); незначительная задержка гемолиза - 1+; сомнительная реакция - +/-. Отрицательный результат реакции характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта.

Таблица N 5

Качественная методика постановки реакции Вассермана

Оценку результатов регистрируют в книге протоколов лаборатории.

Результаты реакции следует давать по каждому антигену отдельно.

В случае расхождения результатов между антигенами необходимо повторное исследование новой порции сыворотки крови; повторное исследование необходимо также при наличии задержки гемолиза в контроле сыворотки крови (третья пробирка, не содержащая антигена).

Правильность течения опыта оценивают на основании следующих результатов:

1) контроля испытуемой сыворотки крови - третий ряд пробирок (отрицательный);

2) контроля с заведомо отрицательной сывороткой крови (отрицательный);

3) контроля с заведомо положительной (3+ или 4+) и слабоположительной (2+) сыворотками крови.

В качестве контрольных используют лиофилизированные сыворотки крови.

Сыворотки крови положительные и слабоположительные получают из крови кроликов, зараженных патогенными бледными трепонемами (штамм Никольса), отрицательные - из крови здоровых кроликов.

Сухие сыворотки крови выпускают в ампулах по 1 мл. В день постановки реакции сыворотку крови растворяют добавлением изотонического раствора натрия хлорида для восстановления первоначального (до высушивания) объема.

После полного растворения сыворотки крови инактивируют при 56° в течение 30 минут. Положительные и слабоположительные сыворотки крови должны давать задержку гемолиза на 4+ и 2+ соответственно при разведении 1: 5 по качественной методике постановки реакции Вассермана с кардиолипиновым и трепонемным антигенами.

Если рабочая доза комплемента выбрана неправильно (избыток комплемента), то со слабоположительной сывороткой крови будет получен отрицательный результат реакции; при недостатке комплемента наблюдается задержка гемолиза с контрольной отрицательной сывороткой крови и в контроле испытуемых сывороток крови (3-й ряд пробирок).

Источники ошибок

Нарушение условий и методики постановки реакции.

Несоблюдение условий и срока хранения испытуемой сыворотки крови, антигенов, комплемента, эритроцитов барана.

Изменение процентного содержания натрия хлорида.

Неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте).

Исключение из постановки реакции контрольных положительных и слабоположительных сывороток крови.

Использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.

Количественная методика постановки реакции Вассермана

Определение титра реагинов и противотрепонемных антител в положительных сыворотках крови производится путем исследования в реакции связывания комплемента уменьшающихся объемов сыворотки крови, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида. Количественный метод постановки реакции Вассермана ставят с положительными сыворотками крови, давшими 4+ с кардиолипиновым или трепонемным антигенами.

Сыворотки крови повторно инактивируют 15 минут при 56° в инактиваторе.

Каждую сыворотку крови исследуют в 8 пробирках (таблица N 6). В первую пробирку наливают 0,8 мл изотонического раствора натрия хлорида, со второй по 7-ю пробирку - по 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку вносят 0,2 мл испытуемой сыворотки крови, содержимое перемешивают, затем 0,25 мл удаляют, а по 0,25 мл переносят во вторую и восьмую пробирки. После перемешивания переносят 0,25 мл из второй пробирки в третью, из третьей - в четвертую и т.д. до седьмой пробирки, из которой 0,25 мл разведенной сыворотки крови удаляют. Затем приливают по 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенного по титру, с первой по седьмую, а в 8-ю пробирку 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. После легкого встряхивания во все пробирки приливают по 0,25 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Первичная инкубация в термостате при 37° продолжается 45 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,5 мл гемолитической системы. Встряхнув пробирки, их помещают в термостат при 37° на 45-60 минут и после наступления полного гемолиза в восьмой (контрольной) пробирке регистрируют результаты реакции.

Оценка результатов. Титром реагинов исследуемой сыворотки крови является последнее разведение, давшее задержку гемолиза.

Таблица N 6

Количественная методика постановки реакции Вассермана

В данном случае титр сыворотки крови 1 : 40

В выдаваемых лабораторией анализах при наличии резкоположительной реакции (4+) указывают, с каким титром испытуемой сыворотки крови получена положительная реакция.

Количественное определение реагинов имеет значение при оценке эффективности противосифилитического лечения. Быстрое снижение титра реагинов свидетельствует об успешности терапии. Длительно не снижающийся титр реагинов указывает на отсутствие эффективности терапии и необходимость ее изменения.

Источники ошибок

Те же, что и при качественной методике постановки реакции Вассермана.

Методика постановки реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью

В спинномозговой жидкости больного сифилисом могут находиться противотрепонемные антитела и реагины, способные вступать в реакцию связывания комплемента с соответствующими антигенами.

Реакцию ставят с непрогретой спинномозговой жидкостью, ввиду отсутствия в ней комплемента.

Мутную или с примесью крови жидкость центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость.

Спинномозговую жидкость параллельно исследуют в трех дозах: 1) неразведенную; 2) разведенную изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 2, 3) разведенную изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 5 (таблица N 7).

Реакцию производят с двумя антигенами параллельно - трепонемным и кардиолипиновым - с каждым разведением спинномозговой жидкости по схеме (таблица N 7).

Ввиду отсутствия антикомплементарных свойств спинномозговой жидкости для ее исследования комплемент в реакцию вводят по титру (первая растворяющая доза без обычной надбавки). Для повышения чувствительности реакции связывания комплемента со спинномозговой жидкостью рекомендуется применять модификацию на холоде, методика которой изложена ниже.

Оценка результатов

Результаты реакции учитывают отдельно для каждого антигена и разведения спинномозговой жидкости. Для обозначения позитивности реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью пользуются системой четырех плюсов, описанной выше.

Таблица N 7

Методика постановки реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью

Источники ошибок

Нарушение условий и методики постановки реакции.

Несоблюдение условий и срока хранения спинномозговой жидкости, антигенов, комплемента, эритроцитов барана.

Изменение процентного содержания натрия хлорида.

Неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте).

Использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.

Качественная методика постановки реакции Вассермана на холоде

Особенностью методики постановки реакции Вассермана на холоде является трехфазность температурных режимов, при которых протекает связывание комплемента. При выборе рабочей дозы комплемента ее вычисляют с 50% надбавкой к рабочей дозе, полученной при титровании комплемента для качественной реакции Вассермана.

Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1 : 5 изотоническим раствором натрия хлорида, исследуют в 3 пробирках, предварительно разлив в каждую по 0,25 мл. В первую пробирку добавляют 0,25 мл трепонемного антигена, разведенного по титру; во вторую 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенного по титру; в третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. После встряхивания все пробирки оставляют при комнатной температуре на 10 минут (первая фаза реакции). Затем добавляют комплемент по 0,25 мл, разведенный с 50% надбавкой к рабочей дозе во все опытные и контрольные пробирки. После встряхивания все пробирки помещают в холодильник при 4° на 15-18 часов (вторая фаза реакции). В аналогичных условиях выдерживается гемолитическая система. На следующий день содержимое пробирок и гемолитическую систему выдерживают при комнатной температуре 15 минут с последующей инкубацией в термостате при 37° 15 минут, после чего во все пробирки добавляют по 0,5 мл гемолитической системы. После встряхивания пробирки помещают в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке исследуемой сыворотки крови (третья фаза реакции) (таблица N 8).

Оценка результатов и источники ошибок

Те же, что и при качественной методике постановки реакции Вассермана по термостатному методу.

Таблица N 8

Качественная методика постановки реакции Вассермана на холоде

Принцип

Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом вступают в соединение с липидным антигеном (антиген Кана). Образующийся комплекс антиген-антитело выпадает в осадок в виде макрофлокулята.

Оборудование

Холодильник с температурой 4-6°.

Термостат с температурой 37°.

Центрифуга.

Инактиватор с температурой 56°.

Аппарат для встряхивания (шуттель-аппарат).

Пробирки размером 11 x 75 мм.

Пипетки градуированные 0,1 и 0,2 мл с делениями на 0,001.

Пипетки градуированные на 1, 2 мл с делениями на 0,01.

Пипетки градуированные 5, 10 мл с делениями на 0,1.

Стеклянные стаканчики емкостью 20, 50 мл.

Банки стеклянные емкостью 50, 100, 200 мл.

Ингредиенты

0,9% изотонический раствор натрия хлорида. В 1 литре дистиллированной воды растворяют 9 г натрия хлорида, химически чистого. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Антиген Кана. Антиген разводят по титру способом, указанным на этикетке. Хранят в темном месте при комнатной температуре во флаконах или пробирках плотно закрытых корковыми пробками.

Испытуемая сыворотка крови. Взятие крови, получение сыворотки крови и обработка испытуемой сыворотки крови производится также, как для реакции Вассермана.

Методика постановки реакции

Подготовительная работа

Приготовление 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, сливание испытуемых сывороток крови со сгустка, их инактивация, разведение антигена по титру.

Расход ингредиентов на 100 исследований

Натрий хлорид, х. ч. - 9 г.

Антиген Кана - 1,8 мл.

Приготовление разведения антигена

Антиген разводят по титру, указанному на этикетке, который, как правило, бывает 1+1, 1+1,1, 1+1,2, 1+1,3, т.е. на каждый 1 мл антигена добавляют 1 мл, 1,1 мл, 1,2 мл, 1,3 мл 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. Для приготовления разведенного антигена в низкий стеклянный стаканчик отмеривают необходимый для данного рабочего дня объем 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, во второй стеклянный стаканчик - необходимое количество антигена Кана. Для отмеривания антигена Кана обязательно пользоваться сухой пипеткой. Затем 0,9% изотонический раствор натрия хлорида быстро вливают в антиген и смесь перемешивают, переливая из стаканчика в стаканчик 6-7 раз. Разведенный антиген оставляют на 10 минут при комнатной температуре (созревание). Созревшая антигенная эмульсия пригодна в течение 15 минут. Поэтому при большом количестве исследуемых сывороток крови рекомендуется готовить разведение отдельными порциями.

Основной опыт

В пробирку, опущенной на дно градуированной пипеткой (на 0,1 или 0,2 мл), вносят 0,025 мл разведенного антигена. Затем приливают 0,15 мл исследуемой инактивированной сыворотки крови и встряхивают на шуттель-аппарате 3 минуты, затем приливают 0,5 мл 0,9% изотонического раствора натрия хлорида и вновь встряхивают до полного перемешивания содержимого пробирки. Для опыта ставят 4 контроля: контроль антигена, контрольные положительную, слабо-положительную и отрицательную сыворотки крови (табл. N 9).

Таблица N 9

Методика постановки реакции Кана

Оценка результатов

Определение результатов реакции Кана производят непосредственно после добавления 0,9% изотонического раствора натрия хлорида невооруженным глазом или при помощи лупы или агглютиноскопа. Для обозначения степени позитивности реакции Кана пользуются системой четырех плюсов: выпадение крупных хлопьев, жидкость прозрачная - 4+, резко положительная реакция; образование ясного преципитата со значительным просветлением жидкости - 3+, положительный результат реакции, образование преципитата со взвешенными мелкими частицами в мутноватой жидкости - 2+, слабо положительная реакция; мелкие частицы взвешены в мутной жидкости - 1+, сомнительная реакция; отсутствие взвешенных частиц в прозрачной опалесцирующей жидкости в опытной пробирке, в пробирках с контролем антигена и заведомо отрицательной сывороткой крови регистрируют как отрицательный результат реакции Кана.

Источники ошибок

Нарушение условий и методики постановки реакции.

Нарушение условий и срока хранения испытуемых сывороток крови, антигена.

Изменение процентного содержания натрия хлорида.

Исключение из постановки реакции контрольных положительной, слабоположительной и отрицательной сывороток крови.

Использование загрязненной лабораторной посуды и пипеток.

Принцип

Реакция основана на феномене потери бледными трепонемами подвижности в присутствии иммобилизируюших противотрепонемных антител исследуемой сыворотки крови и комплемента в условиях анаэробиоза. Постановке реакции предшествует подготовительная работа.

Обработка лабораторной посуды

Вся лабораторная посуда (пипетки, пробирки, флаконы и т.п.), используемая для постановки реакции иммобилизации трепонем, должна быть стерильной. Перед стерилизацией ее моют без применения дезинфицирующих средств. Для этого после опыта пробирки и флаконы погружают в мыльную воду комнатной температуры, кипятят в течение 40 минут, охлаждают до 40° и моют водопроводной сначала теплой, а затем холодной водой, наливая ее в каждую пробирку 5-7 раз, после чего 1 раз промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Высушенную посуду завертывают в бумагу и стерилизуют автоклавированием в течение 30 минут при 2 атмосферах по манометру. После стерилизации посуду вновь высушивают в сушильном шкафу и хранят в боксе в течение 7 дней.

Получение исследуемой сыворотки крови и ее обработка

Перед взятием крови обследуемый не должен получать медикаменты, особенно препараты пенициллина. Прием препаратов отменяют на срок их возможной задержки в организме. После отмены бициллина кровь берут через 1 месяц. При использовании пенициллиназы при постановке реакции прекращение введения препаратов пенициллина не обязательно.

Кровь для реакции берут из локтевой вены натощак стерильно, в сухую, химически чистую и стерильную пробирку. Кожу локтевого сгиба перед проколом протирают 70° спиртом. Взятую кровь обрабатывают так же, как для реакции Вассермана, но с соблюдением условий стерильности. В реакции используют сыворотку крови, инактивированную в течение 30 минут в водяной бане при 56° для исключения действия неспецифических иммобилизинов. При необходимости повторного исследования одной и той же сыворотки крови ее инактивирование проводят повторно, но в течение 15 минут. Перед исследованием сыворотку крови можно хранить в холодильнике в течение 10-15 дней при - 10°, а при 4° в течение 5 дней. Никаких консервантов в сыворотку крови не добавляют.

В реакции можно исследовать сыворотки крови, высушенные на вощаной бумаге, с добавлением по 3 капли на каждые 0,5 мл сыворотки крови свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара. Такие сыворотки крови должны быть исследованы не позднее 5 дней после высушивания в южных районах страны, а также в летнее время года, и не позднее 10 дней на остальных территориях страны. Следует помнить, что результаты исследования сыворотки крови с невысоким содержанием антител негативируются быстрее, поэтому не следует широко применять высушенные сыворотки крови. Для растворения к высушенным сывороткам крови, помещенным в пробирку, добавляют 0,9% изотонический раствор натрия хлорида, восстанавливая их первоначальный объем, после растворения стерилизуют кварцеванием в течение 30 минут, расположив пробирки на расстоянии 0,5 метра от кварцевой лампы.

Среда выживания для бледных трепонем

Период от момента постановки реакции до регистрации ее результатов длится 18-20 часов, поэтому для сохранения жизнеспособности и хорошей подвижности микроорганизмов необходима среда выживания. Рекомендуется среда N 2 ЦКВИ. Для приготовления среды берут 50 г говяжьего или кроличьего мяса, освобождают его от жира и сухожилий, измельчают, заливают 100 мл водопроводной воды и помещают в холодильник на 24 часа при 4° для экстрагирования. На следующий день кипятят в течение 10 минут кроличье мясо и 20 минут говяжье, охлаждают и фильтруют через многослойный бумажный фильтр. После фильтрования устанавливают РН = 7,2 - 7,4 добавлением 20° раствора едкого натрия. Приготовленную среду стерилизуют автоклавированием в течение 20 минут при 1 атмосфере по манометру и ампулируют. При условии сохранения стерильности среда пригодна для использования в течение 12 месяцев. Ампулы со средой хранят в холодильнике при 4°. Каждую новую партию среды вводят в опыт параллельно со старой средой для выяснения ее качеств.

Комплемент

В реакции иммобилизации используют избыток комплемента. В реакции применяют комплемент морской свинки. Количество его в значительной степени зависит от среды выживания для бледных трепонем. При использовании среды N 2 ЦКВИ в микроанаэростатном методе количество комплемента составляет 27% от общего объема используемых в реакции реагентов, а при постановке в меланжерах - 40%.

Для получения комплемента кровь берут обязательно у нескольких морских свинок так же, как для реакции Вассермана, но с соблюдением условий стерильности. После получения сыворотки крови ее наливают в стерильные пробирки по 1-4 мл и исследуют на стерильность. Для этого 1 мл сыворотки крови морской свинки оставляют в термостате при 37° на сутки. В случае бактериального загрязнения комплемент бракуют. Пробирки с комплементом хранят в холодильнике при -10° в течение 2-3 недель. Повторно замораживание и оттаивание не рекомендуется. Нельзя применять в реакции иммобилизации бледных трепонем консервированный комплемент, т.к. он токсичен для микроорганизмов. Лиофильно высушенный без консерванта комплемент морской свинки также нельзя использовать в реакции, т.к. по качеству он хуже свежего.

Антиген

В качестве антигена в реакции применяют взвесь бледных трепонем из раннего орхита кролика (7-9 суток после заражения). Используют бледные трепонемы штамма Никольса, которые еженедельно пассируют на кроликах. Зараженных кроликов содержат в светлых проветриваемых помещениях. Кормят полноценной пищей, содержащей витамины (морковь-обязательно). Для заражения следует брать здоровых кроликов - самцов весом 2,5-3 кг с отрицательным результатом серологических реакций на сифилис (КСР и РИТ). За 1-2 суток до заражения у кроликов выстригают шерсть в нижней части живота, внутренней поверхности бедер и мошонки. Для получения раннего специфического орхита кролика заражают введением внутрь каждого яичка по 1 мл взвеси бледных трепонем. Во взвеси должно содержаться более 50 микроорганизмов в каждом поле зрения микроскопа при использовании окуляра 7Х и объектива 40.

Введение животным гидрокортизона для подавления иммуногенеза не является строго обязательным. Применение его рекомендуется при уменьшении в яичках числа бледных трепонем при повторных пассажах (менее 50 при исследовании в темном поле зрения). Гидрокортизон вводят внутримышечно в дозе 20 мг перед заражением и в последующие 4-6 дней - 10 мг.

О появлении орхита свидетельствует увеличение размеров яичка и его уплотнение. Для удаления яичек кролика привязывают к станку, обескровливают пункцией сердца под эфирным наркозом, если кролик при этом не погибает, его забивают воздушной эмболией - введением 20 мл воздуха в сердце или в вену уха. Яички выводят через паховый канал в мошонку, поглаживая по животу от середины вниз до мошонки. Поверхность кожи мошонки накрывают стерильной резиновой салфеткой с разрезами, через которые выводят яички. Кожу мошонки над яичками протирают тампоном, смоченным эфиром, приподнимают ее пинцетом сначала над одним яичком и делают разрез ножницами, через который выводят яичко вместе с оболочками, отрезают его у основания ножницами и помещают в стерильную чашку Петри. Далее в условиях бокса каждое яичко освобождают от оболочек, придатков и жира. Помещают в стерильный бюкс, разрезают на 10-14 частей, заливают 5 мл среды N 2 ЦКВИ и полученную взвесь исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения на наличие бледных трепонем. Для этого на предметное стекло пастеровской пипеткой наносят по капле жидкости из каждого бюкса. При наличии трепонем кусочки яичка вместе со средой из бюкса переносят во (флакон емкостью 50 мл и встряхивают во встряхивателе для вымывания микроорганизмов из ткани яичка. Время встряхивания зависит от числа обнаруженных микроорганизмов. При наличии 5-10 бледных трепонем в поле зрения встряхивание длится в течение часа, а при наличии 30-40 трепонем - только 20-30 минут. После встряхивания содержимое флакона переносят в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин для осаждения эритроцитов и кусочков тканей яичка. Надосадочную жидкость переносят в другую стерильную пробирку, из нее готовят препараты на предметном стекле, которые исследуют как было выше описано, определяя приблизительное число бледных трепонем в нескольких полях зрения.

Содержащуюся в пробирке густую взвесь бледных трепонем набирают в шприц и заражают подготовленных кроликов введением 1,0 мл взвеси внутрь каждого яичка.

Для приготовления антигена взвесь бледных трепонем разводят средой N 2 ЦКВИ так, чтобы в поле зрения было 10-15 микроорганизмов. Например, если во взвеси содержится 1000-1500 микроорганизмов в каждом поле зрения (т.е. трепонемы густо покрывают все поле зрения), то на 9,9 мл среды добавляют 0,1 мл взвеси трепонем и получают разведение в 100 раз.

Гемолитическая система

Дефибринированную баранью кровь или эритроциты барана в объеме, необходимом для работы в данный день, центрифугируют, плазму отсасывают, а осадок трижды отмывают 6-7 объемами 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. При последнем промывании надосадочная жидкость должна быть бесцветной. Из плотного осадка готовят 1% взвесь эритроцитов барана в том же растворе. Нужный объем гемолитической сыворотки, разведенной в изотоническом растворе натрия хлорида по утроенному титру (например, если на этикетке указан титр 1 : 1200, то для разведения используют титр 1 : 400, т.е. 0,1 мл гемолитической сыворотки на 39,9 мл изотонического раствора натрия хлорида) объединяют с равным объемом 1% взвеси эритроцитов барана. Раствор гемолитической сыворотки приливают к взвеси эритроцитов барана и производят быстрое смешивание. Полученную гемолитическую систему выдерживают в термостате 30 минут при 37°.

Таблица N 10

Схема реакции иммобилизации бледных трепонем
(микроанаэростатная методика)

Основной опыт

Постановку реакции проводят в боксе. Каждую сыворотку крови исследуют в двух пробирках: опытной и контрольной. В обе пробирки вносят по 0,05 мл исследуемой сыворотки крови и по 0,35 мл антигена. В опытную пробирку наливают 0,15 мл активного комплемента, а в контрольную такое же количество инактивированной сыворотки крови морской свинки. После заполнения содержимое пробирок перемешивают легким встряхиванием и помещают в микроанаэростат. Из микроанаэростата с помощью вакуумного насоса удаляют атмосферный воздух и заполняют его газовой смесью из баллона, в котором содержится азот (95 частей) и углекислый газ (5 частей). При заполнении микроанаэростата газовой смесью следят за тем, чтобы стрелка манометра не доходила до нулевого уровня. В этом случае удается избежать повышения давления внутри анаэростата выше атмосферного в связи с перемещением его из комнаты в термостат с температурой 35°, а также позволяет следить за герметичностью этого прибора. Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат на 18-20 часов.

При постановке реакции применяют 5 контрольных исследований: с заведомо положительной и отрицательной сыворотками крови, взятыми из предыдущего опыта, с активным и инактивированным комплементом и средой выживания для бледных трепонем. Контрольную отрицательную сыворотку крови применяют для суждения о степени подвижности бледных трепонем в данном опыте. Контрольную положительную сыворотку крови - для оценки степени иммобилизирующей активности в условиях данного опыта. Сыворотки крови исследуют по вышеописанной методике. Исследование активного и инактивированного комплемента и среды проводят для определения их влияния на подвижность бледных трепонем (таблица N 10).

Разлив ингредиентов при постановке реакции производят в боксе, предварительно облученном бактерицидной кварцевой лампой в течение 45-60 минут.

Оценку полученных результатов проводят через 18-20 часов. Пробирки вынимают из термостата и микроанаэростата и расставляют в штативе попарно (статная и контрольная). Из каждой пары пробирок пастеровской пипеткой наносят капли на пронумерованные соответственно статным пробиркам предметные стекла, накрывают покровными стеклами 20 x 20 мм и исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения с объективом 40, окуляром 10Х. Просматривают несколько полей зрения в разных участках препарата, подсчитывая в каждом число подвижных и неподвижных бледных трепонем. Подсчет начинают с препарата из контрольной, а затем из опытной пробирки.

В препарате подсчитывают не менее 25 трепонем и отмечают, сколько из них подвижных и сколько неподвижных.

Если в опытном препарате содержится 13-19 подвижных бледных трепонем, то для получения более достоверного результата необходимо сосчитать не 25, а 50 микроорганизмов, также отмечая среди них число подвижных и неподвижных. При подсчете 50 бледных трепонем полученное число подвижных микроорганизмов делят на 2.

Если в контрольном препарате содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 подсчитанных, то такой опыт не пригоден и исследование данной сыворотки крови следует повторить. В контрольных пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижных трепонем объясняется токсичностью исследуемой сыворотки крови, чаще всего вследствие примеси медикаментов, иногда бактериальным загрязнением.

При определении подвижности бледных трепонем следует обращать внимание на интенсивность движений, совершаемых бледной трепонемой. У бледной трепонемы не всегда можно наблюдать сгибательные и контрактильные движения, иногда только вращательные. Следует также уметь отличать активные движения трепонем от движения с током жидкости.

Расчет процента специфической иммобилизации бледных трепонем производят по следующей формуле:

где:

A - число подвижных бледных трепонем в контрольной пробирке,

В - число подвижных бледных трепонем в опытной пробирке,

X - процент иммобилизации.

В практической работе процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице N 11 с применением вышеуказанной формулы. Реакция иммобилизации считается отрицательной, когда процент иммобилизации колеблется в пределах 0-20, сомнительной от 21 до 30, слабоположительной от 31 до 50 и положительной выше 50. Сыворотки крови с сомнительными и слабоположительными результатами реакции нуждаются в повторном исследовании для получения более достоверных результатов. Целесообразно также подвергать повторному исследованию все сыворотки крови, давшие полное расхождение результатов с результатами стандартных серологических реакций. Эти сыворотки крови заслуживают особого внимания, так как в этих случаях результаты реакции иммобилизации бледных трепонем дают возможность судить о наличии или отсутствии сифилиса у обследуемого лица.

Определение остаточного комплемента

Определение остаточного комплемента необходимо для суждения о том, достаточным ли было количество комплемента в опытных пробирках, не была ли подвижность бледных трепонем обусловлена отсутствием комплемента, вследствие чего иммобилизины не могли проявить свою активность.

После регистрации результатов реакции иммобилизации бледных трепонем в содержимом пробирок определяют остаточный комплемент добавлением в каждую пробирку гемолитической системы в объеме 0,1 мл. Пробирки помещают в термостат при 37° на 45 минут. В опытных пробирках должен наступить гемолиз эритроцитов, в контрольных должна быть задержка гемолиза. Отсутствие в опытных пробирках гемолиза указывает на недостаточное количество комплемента, в этих случаях исследование надо повторить. Повторное исследование сыворотки крови не производят только в том случае, если отмечена 100% иммобилизация бледных трепонем.

Источники ошибок

Токсичность исследуемой сыворотки крови.

Бактериальное загрязнение исследуемой сыворотки крови, комплемента, среды.

Недостаточное количество комплемента в опыте.

Нарушение герметичности микроанаэростата, проникновение в него кислорода из атмосферного воздуха.

Повышение или понижение температуры в термостате в течение реакции.

Кислотность или щелочность лабораторной посуды, использованной при постановке реакции.

Таблица N 11

Определение процента иммобилизации бледных трепонем

Примечание: Ответ находит в точке пересечения горизонтальной строки с вертикальным столбцом, например: 22 подвижных трепонемы в контрольной пробирке и 8 подвижных трепонем в опытной пробирке соответствует 63% иммобилизации бледных трепонем.