Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава СССР от 02.09.85 N 1161 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА" (вместе с "ИНСТРУКЦИЕЙ ПО ПОСТАНОВКЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА СИФИЛИС")

Принцип

Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с кардиолипиновым антигеном. Специфические антитрепонемные антитела вступают в соединение со специфическими антигенами (ультраозвученный трепонемный антиген). Образовавшиеся комплексы антиген-антитело сорбирует вводимый в реакцию, комплемент. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (гемолитическая сыворотка + эритроциты барана).

Оборудование

Термостат с температурой 37°.

Холодильник с температурой 4°.

Инактиватор (водяная или суховоздушная баня) с температурой 56°. Центрифуга.

Пробирки размером 14 x 60 мм, 15 x 100 мм, 15 x 150 мм

Пипетки градуированные 1, 2 мл с делениями на 0,01 мл

Пипетки градуированные 5, 10 мл с делениями на 0,1 мл

Цилиндры мерные емкостью 100, 250, -500, 1000 мл с делениями на 5 мл.

Стаканы химические, емкостью 100, 250, 500 мл.

Приборы дозировочные для серологических исследований (Флоринского) - ФЛ-3 и ФЛ-4.

Ингредиенты:

0,9% изотонический раствор натрия хлорида.

Испытуемая сыворотка крови.

Взятие крови производят натощак или не ранее 6 часов после приема пищи. Нельзя брать кровь у больных с повышенной температурой, после употребления спиртных напитков ранее 24 часов, перенесших недавно инфекционное заболевание, у женщин во время менструации, беременных в последние 10 дней беременности, рожениц в первые 10 дней после родов, новорожденных в первые 10 дней жизни.

Кровь из локтевой вены в количестве 7 - 10 мл берут в сухую чистую пробирку. Пункцию производят стерильной иглой при соблюдении правил асептики. У грудных детей кровь берут из надреза пятки узким скальпелем.

В лабораторию кровь должна быть доставлена не позднее 48 часов с момента взятия при условии ее хранения в холодильнике при 4°.

Сыворотка крови может быть использована для постановки реакции в день взятия крови.

Доставленную в лабораторию кровь в день ее взятия помещают в термостат при 37° на 15-30 минут. Образовавшийся сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки и центрифугируют 15 минут при 1000 об/мин. Над сгустком образуется прозрачная сыворотка крови, которую при помощи пипетки с резиновым баллоном без примеси эритроцитов переносят в другую пробирку. При наличии в сыворотке крови примеси эритроцитов ее центрифугируют и отделяют от них. Кровь, доставленную в лабораторию накануне постановки реакции, отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки и помещают в холодильник при 4°. Перед постановкой реакции образовавшуюся над сгустком крови сыворотку переносят в другую пробирку.

Снятую со сгустка сыворотку крови инактивируют в суховоздушном инактиваторе или водяной бане в течение 30 минут при 56° для уничтожения естественного комплемента и стабилизации глобулиновых фракций испытуемой сыворотки крови.

Инактивированные сыворотки крови могут храниться в холодильнике в течение 5-6 дней. Сыворотки крови, ранее инактивированные, в день постановки реакции должны быть повторно прогреты в течение 15 минут при 56°. Для более длительного хранения к сыворотке крови после инактивации добавляют сухую борную кислоту (из расчета 2%), что позволяет ею пользоваться в течение 3-4 недель, или замораживают в морозильной камере холодильника на тот же срок, не допуская повторного замораживания и оттаивания.

В случаях, если нельзя немедленно доставить кровь для исследования в лабораторию, можно пользоваться высушенной сывороткой крови. Для этого 2 мл сыворотки крови без примеси эритроцитов наносят на сложенную вдвое вощаную бумагу, целлофан (8 x 10 см) в виде четырех кружочков по 0,5 мл в каждом. К сыворотке крови добавляют по 3 капли свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара на каждые 0,5 мл сыворотки. Предварительно на вощаной бумаге, целлофане надписывают фамилию, имя, отчество, дату взятия крови и объем нанесенной сыворотки крови, которую высушивают при комнатной температуре. Затем вощаную бумагу, целлофан тщательно свертывают в виде аптечного пакетика и в конверте по почте отправляют в ближайшую серологическую лабораторию. Такие сыворотки крови должны быть исследованы не позднее 5 дней с момента взятия крови в южных районах страны, а также в летнее время года, и не позднее 10 дней на остальных территориях страны.

В лаборатории полученную высушенную сыворотку крови ссыпают в пробирку. Для ее растворения добавляют изотонический раствор натрия хлорида, восстанавливая первоначальный объем сыворотки крови. Сыворотка крови растворяется в течение одного часа стояния при комнатной температуре. Затем ее инактивируют при 56° в течение 30 минут, после чего она может быть использована для постановки реакции.

Желтушные, хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки крови для исследования не пригодны.

Антигены

Реакция Вассермана должна ставиться с двумя антигенами: ультраозвученным трепонемным и кардиолипиновым.

Ультраозвученный трепонемный антиген приготовлен из культур бледных трепонем, подвергнутых действию ультразвука.

Ультраозвученный трепонемный антиген выпускают лиофильно высушенным во флаконах по 5 и 10 мл; хранят его в холодильнике при 4°. Срок годности антигена указан на этикетке. Антиген растворяют и разводят изотоническим раствором натрия хлорида соответственно объему и титру, указанному на этикетке флакона.

Кардиолипиновый антиген для реакции Вассермана представляет собой очищенный от балластных примесей спиртовый экстракт липидов из мышц бычьего сердца. Активность антигена обусловливается присутствием трех компонентов - фосфолипида, лецитина и холестерина.

Кардиолипиновый антиген выпускается в ампулах 2 мл; хранят его в темном месте при 15 - 18°. Срок годности антигена указан на этикетке.

Перед употреблением антиген из ампулы переносят в сухую чистую пробирку, плотно закрывают корковой или притертой стеклянной пробкой.

В случае выпадения кристаллов холестерина антиген необходимо прогреть на водяной бане при 56° или в термостате при 37° до полного растворения кристаллов.

Для постановки реакции антиген разводят соответственно титру, указанному на этикетке ампулы. Разведенный антиген должен быть слегка опалесцирующим, но не мутным.

Титр - это количество чистого антигена в 1 мл раствора. Например, если титр ультраозвученного трепонемного антигена 0,05, то для приготовления 10 мл разведенного по титру антигена нужно взять 0,5 мл антигена и 9,5 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Двойные дозы антигенов не должны обладать гемотоксичностью (гемолиз в отсутствии комплемента), что устанавливается соответствующим контролем антигена при титровании комплемента. Антигены не должны быть антикомилементарными (подавление гемолиза), что также устанавливают при параллельном титровании комплемента без генов и в присутствии антигенов, применяемых в реакции связывания комплемента.

Гемолитическая сыворотка (гемолизин)

Это сыворотка крови кролика или осла, иммунизированных эритроцитами барана.

Гемолитическая сыворотка (жидкая или сухая) выпускается в ампулах по 1 мл с указанием титра. Для растворения сухого гемолизина в ампулу добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Гемолитическая сыворотка как сухая, так и растворенная хранится в холодильнике при 4°. Срок годности сухой гемолитической сыворотки указан на этикетке.

Титр используемой гемолитической сыворотки не должен быть ниже 1 : 1200. Определение титра производят по следующей схеме: готовят основное разведение 1 : 100 (0,1 мл гемолитической сыворотки + 9,9 мл изотонического раствора натрия хлорида), из которого делают ряд соответствующих разведений (таблица N 1).

Таблица N 1

Схема разведений гемолизина

Затем в ряд других пробирок отмеряют по 0,5 мл ранее приготовленных разведении гемолитической сыворотки, начиная с 1 : 1000, добавляют по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,5 мл комплемента (комплемент в разведении 1 : 10), а также 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана (таблица N 2); пробирки помещают в термостат при 37° на 1 час, периодически встряхивая 2-3 раза.

Титром гемолитической сыворотки является наивысшее ее разведение, давшее полное растворение 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента. В данном случае титр гемолитической сыворотки - 1 : 1500 (таблица N 2).

Для основного опыта и титрования ингредиентов берут разведение, усиленное против полученного титра в три раза (тройной титр). В данном примере - 1 : 500 (0,1 на 50).

Таблица N 2

Определение титра гемолизина

Эритроциты барана

Баран должен быть в возрасте от 1 до 5 лет. Кровь у него берут путем пункции яремной вены не чаще 1 раза в 10 дней, в количестве не более 200 мл в сухую стерильную банку со стеклянными бусами, которую встряхивают в течение 5-10 минут. Затем кровь фильтруют через двойной слой марли (отделяют образовавшиеся сгустки нитей фибрина).

В день постановки реакции эритроциты барана трех - пятикратно отмывают изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования. Центрифугируют 10 минут при 1,5 тысячах оборотов в минуту. Последнюю бесцветную порцию промывной жидкости сливают, а осадок вновь центрифугируют для его уплотнения. Надосадочную жидкость вновь удаляют, а из плотного осадка готовят 3% взвесь эритроцитов барана в изотоническом растворе натрия хлорида (на 3 мл плотного осадка эритроцитов добавляют 97 мл изотонического раствора натрия хлорида). Отмытые эритроциты в последующие дни в работе не используют. При наличии гемолиза эритроциты барана к употреблению не пригодны.

Дефибринированную кровь сохраняют в широкогорлом сосуде, накрытом стерильной двухслойной марлевой салфеткой в течение 5-7 дней в холодильнике при 4°.

Для хранения дефибринированной крови барана длительное время рекомендуется консервировать ее по методу Мигулиной. Для этого к 100 мл дефибринированной крови барана добавляют 15 мл смеси, приготовленной по следующей прописи: глюкозы - 6,0 г, борной кислоты - 4,5 г, 100 мл изотонического раствора натрия хлорида; приготовленную смесь кипятят на водяной бане 3 дня подряд по 20 минут. Консервированная кровь барана по методу Мигулиной годна к употреблению в течение 3-4 недель. Перед постановкой реакции при использовании консервированной крови эритроциты необходимо отмывать изотоническим раствором натрия хлорида так же, как неконсервированной.

Комплемент

Применяют смесь сыворотки крови, полученной пункцией сердца у 5-10 здоровых морских свинок. Кровь для лучшего свертывания помещают в термостат при 37° на 30 минут. После образования сгустка последний отделяют от стенок пробирки, которую помещают в холодильник при 4° до следующего дня. Полученную прозрачную сыворотку крови сливают и используют как комплемент. Активность этого комплемента при хранении в холодильнике при 4° сохраняется в течение 1-2 суток.

При консервировании сухой борной кислотой и сернокислым натрием комплемент сохраняется в холодильнике при 4° 1-2 месяца (4,0 г борной кислоты + 0,5 г сернокислого натрия на 100 мл комплемента).

Может быть использован лиофильно высушенный комплемент. Сухой комплемент выпускается в ампулах по 1 мл.

Растворение сухого комплемента производят в день постановки реакции изотоническим раствором натрия хлорида при легком встряхивании. В ампулу с сухим комплементом добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Нужное для постановки реакции количество комплемента смешивают из нескольких ампул одной серии.

Непосредственно перед постановкой реакции Вассермана проводят титрование комплементы в присутствии всех ингредиентов, участвующих в опыте.

Комплемент титруют обязательно: а) в чистом виде (без антигенов), т.е. в присутствии только гемолитической системы и б) с каждым антигеном, входящим в опыт. Титрование комплемента проводят также в присутствии инактивированной отрицательной сыворотки крови человека.

При титровании комплемента ингредиенты разводят в следующем порядке:

1. Разводят гемолитическую сыворотку по утроенному титру в изотоническом растворе натрия хлорида.

2. Из плотного осадка эритроцитов готовят 3% взвесь в изотоническом растворе натрия хлорида.

3. Разливают 3% взвесь эритроцитов барана и изотонический раствор натрия хлорида в 5 контрольных пробирок и разведенную по утроенному титру гемолитическую сыворотку (во второй контроль) - таблица N 3.

4. Готовят гемолитическую систему: раствор гемолитической сыворотки, разведенной по утроенному титру, приливают к равному объему 3% взвеси эритроцитов барана и производят быстрое смешивание путем переливания из одной колбы в другую.

Полученную смесь помещают в термостат при 37° на 30 минут для сенсибилизации эритроцитов.

5. Разводят антигены изотоническим раствором натрия хлорида по указанному на этикетке титру.

6. Разводят заведомо отрицательную инактивированную сыворотку крови человека в соотношении 1 : 5 (2 мл сыворотки крови + 8 мл изотонического раствора натрия хлорида).

7. Разводят комплемент 1 : 10 (1 мл комплемента + 9 мл изотонического раствора натрия хлорида).

Титрование комплемента в объеме 1,25 мл

Таблица N 3

Схема проведения контроля

Титрование комплемента проводят в 30 пробирках, поставленных по 10 штук в три ряда. Два ряда пробирок для титрования комплемента в присутствии двух антигенов и третий ряд - для титрования комплемента без антигенов. Пять контрольных пробирок: две - для контроля антигенов и по одной - для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и изотонического раствора натрия хлорида на гемотоксичность - заполняют до объединения раствора гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов барана (таблица N 3).

Комплемент, разведенный 1 : 10, разливают в 10 пробирок первого ряда в дозах: 0,1; 0,16; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44; 0,5; 0,55 мл (таблица N 4).

Таблица N 4

Титрование комплемента в присутствии антигена и
отрицательной сыворотки крови человека

Общий объем содержимого пробирок доводят до 1 мл соответствующими объемами изотонического раствора натрия хлорида: 0,9; 0,84; 0,8; 0,76; 0,7; 0,64; 0,6; 0,56; 0,5; 0,45 мл.

Полученную в каждой пробирке смесь тщательно перемешивают и переносят по 0,25 мл в соответственно стоящие позади два ряда пробирок и 0,25 мл выливают. Затем во все 30 пробирок разливают по 0,25 мл инактивированной отрицательной сыворотки крови человека, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 5. Далее в 10 пробирок первого ряда приливают по 0,25 мл разведенного по титру трепонемного антигена; разведенный по титру кардиолипиновый антиген приливают по 0,25 мл в 10 пробирок второго ряда; изотонический раствор натрия хлорида приливают по 0,25 мл в 10 пробирок третьего ряда.

Штатив с пробирками встряхивают и добавляют по 0,5 мл гемолитической системы в третий ряд пробирок (без антигенов). Штатив с пробирками вновь встряхивают и помещают на 45 минут в термостат при 37°. После инкубации в термостате в 20 пробирок первого и второго рядов добавляют по 0,5 мл гемолитической системы. Содержимое пробирок вновь встряхивают и помещают в термостат при 37° на 45 минут. По истечении 45 минут определяют рабочую дозу комплемента, которая устанавливается следующим образом: в основу берут титр комплемента без антигенов, затем титр комплемента в присутствии антигенов, к которому делают надбавку в пределах 15-30% (в среднем 20%) в зависимости от степени гемолиза в пробирках с меньшим количеством комплемента (таблица N 4).

Титром комплемента является наименьшее его количество, способствующее полному гемолизу эритроцитов барана в присутствии антигена и отрицательной сыворотки крови человека.

В данном случае титр комплемента будет 0,3, а рабочая доза комплемента - 0,36, т.е. 3,6%.

Для каждого рабочего дня готовят необходимый объем комплемента, разведенного по рабочей дозе, исходя из расчета 0,75 мл комплемента на каждую испытуемую сыворотку крови при условии постановки реакции Вассермана с двумя антигенами. Так, на 100 испытуемых сывороток крови необходимо 75 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Следовательно, к 72,3 мл изотонического раствора натрия хлориды нужно прибавить 2,7 мл комплемента.

В случае получения разных титров комплемента в присутствии трепонемного и кардиолипинового антигенов используют разные рабочие дозы комплемента в соответствии с полученными титрами.

Качественная методика постановки реакции Вассермана

В день постановки опыта проводят подготовительную работу (сливание испытуемых сывороток крови со сгустка, их инактивация, отмывание эритроцитов барана от плазмы крови, приготовление изотонического раствора натрия хлорида).

Разводят ингредиенты: гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, антигены по титру. Определяют рабочую дозу комплемента титрованием без антигенов, в присутствии антигенов.

Расход ингредиентов на 100 исследований

Исследование каждой испытуемой сыворотки крови проводят в трех пробирках с двумя антигенами (таблица N 5). Одновременно исследуют для контроля заведомо положительные (4+, 2+) и отрицательную сыворотки крови. Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1 : 5 изотоническим раствором натрия хлорида, разливают по 0,25 мл в три пробирки, из которых третья является контрольной. В первую пробирку добавляют 0,25 мл трепонемного антигена, во вторую - 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенных по титру. В третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Комплемент, разведенный по рабочей дозе, добавляют по 0,25 мл во все опытные и контрольные пробирки. Предварительное смешивание антигена и комплемента не рекомендуется. После первичной 45-минутной инкубации в термостате при 37° добавляют во все пробирки по 0,5 мл гемолитической системы. Легким встряхиванием перемешивают содержимое пробирок и помещают их в термостат при 37° на 45-50 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке. Регистрируют результат реакции по наличию или отсутствию гемолиза в опытных пробирках.

Оценка результатов

Для обозначения степени позитивности реакции Вассермана пользуются системой четырех плюсов:

полная задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - 2+ (слабоположительная реакция); незначительная задержка гемолиза - 1+; сомнительная реакция - +/-. Отрицательный результат реакции характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта.

Таблица N 5

Качественная методика постановки реакции Вассермана

Оценку результатов регистрируют в книге протоколов лаборатории.

Результаты реакции следует давать по каждому антигену отдельно.

В случае расхождения результатов между антигенами необходимо повторное исследование новой порции сыворотки крови; повторное исследование необходимо также при наличии задержки гемолиза в контроле сыворотки крови (третья пробирка, не содержащая антигена).

Правильность течения опыта оценивают на основании следующих результатов:

1) контроля испытуемой сыворотки крови - третий ряд пробирок (отрицательный);

2) контроля с заведомо отрицательной сывороткой крови (отрицательный);

3) контроля с заведомо положительной (3+ или 4+) и слабоположительной (2+) сыворотками крови.

В качестве контрольных используют лиофилизированные сыворотки крови.

Сыворотки крови положительные и слабоположительные получают из крови кроликов, зараженных патогенными бледными трепонемами (штамм Никольса), отрицательные - из крови здоровых кроликов.

Сухие сыворотки крови выпускают в ампулах по 1 мл. В день постановки реакции сыворотку крови растворяют добавлением изотонического раствора натрия хлорида для восстановления первоначального (до высушивания) объема.

После полного растворения сыворотки крови инактивируют при 56° в течение 30 минут. Положительные и слабоположительные сыворотки крови должны давать задержку гемолиза на 4+ и 2+ соответственно при разведении 1: 5 по качественной методике постановки реакции Вассермана с кардиолипиновым и трепонемным антигенами.

Если рабочая доза комплемента выбрана неправильно (избыток комплемента), то со слабоположительной сывороткой крови будет получен отрицательный результат реакции; при недостатке комплемента наблюдается задержка гемолиза с контрольной отрицательной сывороткой крови и в контроле испытуемых сывороток крови (3-й ряд пробирок).

Источники ошибок

Нарушение условий и методики постановки реакции.

Несоблюдение условий и срока хранения испытуемой сыворотки крови, антигенов, комплемента, эритроцитов барана.

Изменение процентного содержания натрия хлорида.

Неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте).

Исключение из постановки реакции контрольных положительных и слабоположительных сывороток крови.

Использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.

Количественная методика постановки реакции Вассермана

Определение титра реагинов и противотрепонемных антител в положительных сыворотках крови производится путем исследования в реакции связывания комплемента уменьшающихся объемов сыворотки крови, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида. Количественный метод постановки реакции Вассермана ставят с положительными сыворотками крови, давшими 4+ с кардиолипиновым или трепонемным антигенами.

Сыворотки крови повторно инактивируют 15 минут при 56° в инактиваторе.

Каждую сыворотку крови исследуют в 8 пробирках (таблица N 6). В первую пробирку наливают 0,8 мл изотонического раствора натрия хлорида, со второй по 7-ю пробирку - по 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку вносят 0,2 мл испытуемой сыворотки крови, содержимое перемешивают, затем 0,25 мл удаляют, а по 0,25 мл переносят во вторую и восьмую пробирки. После перемешивания переносят 0,25 мл из второй пробирки в третью, из третьей - в четвертую и т.д. до седьмой пробирки, из которой 0,25 мл разведенной сыворотки крови удаляют. Затем приливают по 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенного по титру, с первой по седьмую, а в 8-ю пробирку 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. После легкого встряхивания во все пробирки приливают по 0,25 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Первичная инкубация в термостате при 37° продолжается 45 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,5 мл гемолитической системы. Встряхнув пробирки, их помещают в термостат при 37° на 45-60 минут и после наступления полного гемолиза в восьмой (контрольной) пробирке регистрируют результаты реакции.

Оценка результатов. Титром реагинов исследуемой сыворотки крови является последнее разведение, давшее задержку гемолиза.

Таблица N 6

Количественная методика постановки реакции Вассермана

В данном случае титр сыворотки крови 1 : 40

В выдаваемых лабораторией анализах при наличии резкоположительной реакции (4+) указывают, с каким титром испытуемой сыворотки крови получена положительная реакция.

Количественное определение реагинов имеет значение при оценке эффективности противосифилитического лечения. Быстрое снижение титра реагинов свидетельствует об успешности терапии. Длительно не снижающийся титр реагинов указывает на отсутствие эффективности терапии и необходимость ее изменения.

Источники ошибок

Те же, что и при качественной методике постановки реакции Вассермана.

Методика постановки реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью

В спинномозговой жидкости больного сифилисом могут находиться противотрепонемные антитела и реагины, способные вступать в реакцию связывания комплемента с соответствующими антигенами.

Реакцию ставят с непрогретой спинномозговой жидкостью, ввиду отсутствия в ней комплемента.

Мутную или с примесью крови жидкость центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость.

Спинномозговую жидкость параллельно исследуют в трех дозах: 1) неразведенную; 2) разведенную изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 2, 3) разведенную изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 5 (таблица N 7).

Реакцию производят с двумя антигенами параллельно - трепонемным и кардиолипиновым - с каждым разведением спинномозговой жидкости по схеме (таблица N 7).

Ввиду отсутствия антикомплементарных свойств спинномозговой жидкости для ее исследования комплемент в реакцию вводят по титру (первая растворяющая доза без обычной надбавки). Для повышения чувствительности реакции связывания комплемента со спинномозговой жидкостью рекомендуется применять модификацию на холоде, методика которой изложена ниже.

Оценка результатов

Результаты реакции учитывают отдельно для каждого антигена и разведения спинномозговой жидкости. Для обозначения позитивности реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью пользуются системой четырех плюсов, описанной выше.

Таблица N 7

Методика постановки реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью

Источники ошибок

Нарушение условий и методики постановки реакции.

Несоблюдение условий и срока хранения спинномозговой жидкости, антигенов, комплемента, эритроцитов барана.

Изменение процентного содержания натрия хлорида.

Неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте).

Использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.

Качественная методика постановки реакции Вассермана на холоде

Особенностью методики постановки реакции Вассермана на холоде является трехфазность температурных режимов, при которых протекает связывание комплемента. При выборе рабочей дозы комплемента ее вычисляют с 50% надбавкой к рабочей дозе, полученной при титровании комплемента для качественной реакции Вассермана.

Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1 : 5 изотоническим раствором натрия хлорида, исследуют в 3 пробирках, предварительно разлив в каждую по 0,25 мл. В первую пробирку добавляют 0,25 мл трепонемного антигена, разведенного по титру; во вторую 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенного по титру; в третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. После встряхивания все пробирки оставляют при комнатной температуре на 10 минут (первая фаза реакции). Затем добавляют комплемент по 0,25 мл, разведенный с 50% надбавкой к рабочей дозе во все опытные и контрольные пробирки. После встряхивания все пробирки помещают в холодильник при 4° на 15-18 часов (вторая фаза реакции). В аналогичных условиях выдерживается гемолитическая система. На следующий день содержимое пробирок и гемолитическую систему выдерживают при комнатной температуре 15 минут с последующей инкубацией в термостате при 37° 15 минут, после чего во все пробирки добавляют по 0,5 мл гемолитической системы. После встряхивания пробирки помещают в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке исследуемой сыворотки крови (третья фаза реакции) (таблица N 8).

Оценка результатов и источники ошибок

Те же, что и при качественной методике постановки реакции Вассермана по термостатному методу.

Таблица N 8

Качественная методика постановки реакции Вассермана на холоде