Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздрава СССР от 02.09.85 N 1161 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА" (вместе с "ИНСТРУКЦИЕЙ ПО ПОСТАНОВКЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА СИФИЛИС")

Принцип

Реакция основана на феномене потери бледными трепонемами подвижности в присутствии иммобилизируюших противотрепонемных антител исследуемой сыворотки крови и комплемента в условиях анаэробиоза. Постановке реакции предшествует подготовительная работа.

Обработка лабораторной посуды

Вся лабораторная посуда (пипетки, пробирки, флаконы и т.п.), используемая для постановки реакции иммобилизации трепонем, должна быть стерильной. Перед стерилизацией ее моют без применения дезинфицирующих средств. Для этого после опыта пробирки и флаконы погружают в мыльную воду комнатной температуры, кипятят в течение 40 минут, охлаждают до 40° и моют водопроводной сначала теплой, а затем холодной водой, наливая ее в каждую пробирку 5-7 раз, после чего 1 раз промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Высушенную посуду завертывают в бумагу и стерилизуют автоклавированием в течение 30 минут при 2 атмосферах по манометру. После стерилизации посуду вновь высушивают в сушильном шкафу и хранят в боксе в течение 7 дней.

Получение исследуемой сыворотки крови и ее обработка

Перед взятием крови обследуемый не должен получать медикаменты, особенно препараты пенициллина. Прием препаратов отменяют на срок их возможной задержки в организме. После отмены бициллина кровь берут через 1 месяц. При использовании пенициллиназы при постановке реакции прекращение введения препаратов пенициллина не обязательно.

Кровь для реакции берут из локтевой вены натощак стерильно, в сухую, химически чистую и стерильную пробирку. Кожу локтевого сгиба перед проколом протирают 70° спиртом. Взятую кровь обрабатывают так же, как для реакции Вассермана, но с соблюдением условий стерильности. В реакции используют сыворотку крови, инактивированную в течение 30 минут в водяной бане при 56° для исключения действия неспецифических иммобилизинов. При необходимости повторного исследования одной и той же сыворотки крови ее инактивирование проводят повторно, но в течение 15 минут. Перед исследованием сыворотку крови можно хранить в холодильнике в течение 10-15 дней при - 10°, а при 4° в течение 5 дней. Никаких консервантов в сыворотку крови не добавляют.

В реакции можно исследовать сыворотки крови, высушенные на вощаной бумаге, с добавлением по 3 капли на каждые 0,5 мл сыворотки крови свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара. Такие сыворотки крови должны быть исследованы не позднее 5 дней после высушивания в южных районах страны, а также в летнее время года, и не позднее 10 дней на остальных территориях страны. Следует помнить, что результаты исследования сыворотки крови с невысоким содержанием антител негативируются быстрее, поэтому не следует широко применять высушенные сыворотки крови. Для растворения к высушенным сывороткам крови, помещенным в пробирку, добавляют 0,9% изотонический раствор натрия хлорида, восстанавливая их первоначальный объем, после растворения стерилизуют кварцеванием в течение 30 минут, расположив пробирки на расстоянии 0,5 метра от кварцевой лампы.

Среда выживания для бледных трепонем

Период от момента постановки реакции до регистрации ее результатов длится 18-20 часов, поэтому для сохранения жизнеспособности и хорошей подвижности микроорганизмов необходима среда выживания. Рекомендуется среда N 2 ЦКВИ. Для приготовления среды берут 50 г говяжьего или кроличьего мяса, освобождают его от жира и сухожилий, измельчают, заливают 100 мл водопроводной воды и помещают в холодильник на 24 часа при 4° для экстрагирования. На следующий день кипятят в течение 10 минут кроличье мясо и 20 минут говяжье, охлаждают и фильтруют через многослойный бумажный фильтр. После фильтрования устанавливают РН = 7,2 - 7,4 добавлением 20° раствора едкого натрия. Приготовленную среду стерилизуют автоклавированием в течение 20 минут при 1 атмосфере по манометру и ампулируют. При условии сохранения стерильности среда пригодна для использования в течение 12 месяцев. Ампулы со средой хранят в холодильнике при 4°. Каждую новую партию среды вводят в опыт параллельно со старой средой для выяснения ее качеств.

Комплемент

В реакции иммобилизации используют избыток комплемента. В реакции применяют комплемент морской свинки. Количество его в значительной степени зависит от среды выживания для бледных трепонем. При использовании среды N 2 ЦКВИ в микроанаэростатном методе количество комплемента составляет 27% от общего объема используемых в реакции реагентов, а при постановке в меланжерах - 40%.

Для получения комплемента кровь берут обязательно у нескольких морских свинок так же, как для реакции Вассермана, но с соблюдением условий стерильности. После получения сыворотки крови ее наливают в стерильные пробирки по 1-4 мл и исследуют на стерильность. Для этого 1 мл сыворотки крови морской свинки оставляют в термостате при 37° на сутки. В случае бактериального загрязнения комплемент бракуют. Пробирки с комплементом хранят в холодильнике при -10° в течение 2-3 недель. Повторно замораживание и оттаивание не рекомендуется. Нельзя применять в реакции иммобилизации бледных трепонем консервированный комплемент, т.к. он токсичен для микроорганизмов. Лиофильно высушенный без консерванта комплемент морской свинки также нельзя использовать в реакции, т.к. по качеству он хуже свежего.

Антиген

В качестве антигена в реакции применяют взвесь бледных трепонем из раннего орхита кролика (7-9 суток после заражения). Используют бледные трепонемы штамма Никольса, которые еженедельно пассируют на кроликах. Зараженных кроликов содержат в светлых проветриваемых помещениях. Кормят полноценной пищей, содержащей витамины (морковь-обязательно). Для заражения следует брать здоровых кроликов - самцов весом 2,5-3 кг с отрицательным результатом серологических реакций на сифилис (КСР и РИТ). За 1-2 суток до заражения у кроликов выстригают шерсть в нижней части живота, внутренней поверхности бедер и мошонки. Для получения раннего специфического орхита кролика заражают введением внутрь каждого яичка по 1 мл взвеси бледных трепонем. Во взвеси должно содержаться более 50 микроорганизмов в каждом поле зрения микроскопа при использовании окуляра 7Х и объектива 40.

Введение животным гидрокортизона для подавления иммуногенеза не является строго обязательным. Применение его рекомендуется при уменьшении в яичках числа бледных трепонем при повторных пассажах (менее 50 при исследовании в темном поле зрения). Гидрокортизон вводят внутримышечно в дозе 20 мг перед заражением и в последующие 4-6 дней - 10 мг.

О появлении орхита свидетельствует увеличение размеров яичка и его уплотнение. Для удаления яичек кролика привязывают к станку, обескровливают пункцией сердца под эфирным наркозом, если кролик при этом не погибает, его забивают воздушной эмболией - введением 20 мл воздуха в сердце или в вену уха. Яички выводят через паховый канал в мошонку, поглаживая по животу от середины вниз до мошонки. Поверхность кожи мошонки накрывают стерильной резиновой салфеткой с разрезами, через которые выводят яички. Кожу мошонки над яичками протирают тампоном, смоченным эфиром, приподнимают ее пинцетом сначала над одним яичком и делают разрез ножницами, через который выводят яичко вместе с оболочками, отрезают его у основания ножницами и помещают в стерильную чашку Петри. Далее в условиях бокса каждое яичко освобождают от оболочек, придатков и жира. Помещают в стерильный бюкс, разрезают на 10-14 частей, заливают 5 мл среды N 2 ЦКВИ и полученную взвесь исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения на наличие бледных трепонем. Для этого на предметное стекло пастеровской пипеткой наносят по капле жидкости из каждого бюкса. При наличии трепонем кусочки яичка вместе со средой из бюкса переносят во (флакон емкостью 50 мл и встряхивают во встряхивателе для вымывания микроорганизмов из ткани яичка. Время встряхивания зависит от числа обнаруженных микроорганизмов. При наличии 5-10 бледных трепонем в поле зрения встряхивание длится в течение часа, а при наличии 30-40 трепонем - только 20-30 минут. После встряхивания содержимое флакона переносят в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин для осаждения эритроцитов и кусочков тканей яичка. Надосадочную жидкость переносят в другую стерильную пробирку, из нее готовят препараты на предметном стекле, которые исследуют как было выше описано, определяя приблизительное число бледных трепонем в нескольких полях зрения.

Содержащуюся в пробирке густую взвесь бледных трепонем набирают в шприц и заражают подготовленных кроликов введением 1,0 мл взвеси внутрь каждого яичка.

Для приготовления антигена взвесь бледных трепонем разводят средой N 2 ЦКВИ так, чтобы в поле зрения было 10-15 микроорганизмов. Например, если во взвеси содержится 1000-1500 микроорганизмов в каждом поле зрения (т.е. трепонемы густо покрывают все поле зрения), то на 9,9 мл среды добавляют 0,1 мл взвеси трепонем и получают разведение в 100 раз.

Гемолитическая система

Дефибринированную баранью кровь или эритроциты барана в объеме, необходимом для работы в данный день, центрифугируют, плазму отсасывают, а осадок трижды отмывают 6-7 объемами 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. При последнем промывании надосадочная жидкость должна быть бесцветной. Из плотного осадка готовят 1% взвесь эритроцитов барана в том же растворе. Нужный объем гемолитической сыворотки, разведенной в изотоническом растворе натрия хлорида по утроенному титру (например, если на этикетке указан титр 1 : 1200, то для разведения используют титр 1 : 400, т.е. 0,1 мл гемолитической сыворотки на 39,9 мл изотонического раствора натрия хлорида) объединяют с равным объемом 1% взвеси эритроцитов барана. Раствор гемолитической сыворотки приливают к взвеси эритроцитов барана и производят быстрое смешивание. Полученную гемолитическую систему выдерживают в термостате 30 минут при 37°.

Таблица N 10

Схема реакции иммобилизации бледных трепонем
(микроанаэростатная методика)

Основной опыт

Постановку реакции проводят в боксе. Каждую сыворотку крови исследуют в двух пробирках: опытной и контрольной. В обе пробирки вносят по 0,05 мл исследуемой сыворотки крови и по 0,35 мл антигена. В опытную пробирку наливают 0,15 мл активного комплемента, а в контрольную такое же количество инактивированной сыворотки крови морской свинки. После заполнения содержимое пробирок перемешивают легким встряхиванием и помещают в микроанаэростат. Из микроанаэростата с помощью вакуумного насоса удаляют атмосферный воздух и заполняют его газовой смесью из баллона, в котором содержится азот (95 частей) и углекислый газ (5 частей). При заполнении микроанаэростата газовой смесью следят за тем, чтобы стрелка манометра не доходила до нулевого уровня. В этом случае удается избежать повышения давления внутри анаэростата выше атмосферного в связи с перемещением его из комнаты в термостат с температурой 35°, а также позволяет следить за герметичностью этого прибора. Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат на 18-20 часов.

При постановке реакции применяют 5 контрольных исследований: с заведомо положительной и отрицательной сыворотками крови, взятыми из предыдущего опыта, с активным и инактивированным комплементом и средой выживания для бледных трепонем. Контрольную отрицательную сыворотку крови применяют для суждения о степени подвижности бледных трепонем в данном опыте. Контрольную положительную сыворотку крови - для оценки степени иммобилизирующей активности в условиях данного опыта. Сыворотки крови исследуют по вышеописанной методике. Исследование активного и инактивированного комплемента и среды проводят для определения их влияния на подвижность бледных трепонем (таблица N 10).

Разлив ингредиентов при постановке реакции производят в боксе, предварительно облученном бактерицидной кварцевой лампой в течение 45-60 минут.

Оценку полученных результатов проводят через 18-20 часов. Пробирки вынимают из термостата и микроанаэростата и расставляют в штативе попарно (статная и контрольная). Из каждой пары пробирок пастеровской пипеткой наносят капли на пронумерованные соответственно статным пробиркам предметные стекла, накрывают покровными стеклами 20 x 20 мм и исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения с объективом 40, окуляром 10Х. Просматривают несколько полей зрения в разных участках препарата, подсчитывая в каждом число подвижных и неподвижных бледных трепонем. Подсчет начинают с препарата из контрольной, а затем из опытной пробирки.

В препарате подсчитывают не менее 25 трепонем и отмечают, сколько из них подвижных и сколько неподвижных.

Если в опытном препарате содержится 13-19 подвижных бледных трепонем, то для получения более достоверного результата необходимо сосчитать не 25, а 50 микроорганизмов, также отмечая среди них число подвижных и неподвижных. При подсчете 50 бледных трепонем полученное число подвижных микроорганизмов делят на 2.

Если в контрольном препарате содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 подсчитанных, то такой опыт не пригоден и исследование данной сыворотки крови следует повторить. В контрольных пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижных трепонем объясняется токсичностью исследуемой сыворотки крови, чаще всего вследствие примеси медикаментов, иногда бактериальным загрязнением.

При определении подвижности бледных трепонем следует обращать внимание на интенсивность движений, совершаемых бледной трепонемой. У бледной трепонемы не всегда можно наблюдать сгибательные и контрактильные движения, иногда только вращательные. Следует также уметь отличать активные движения трепонем от движения с током жидкости.

Расчет процента специфической иммобилизации бледных трепонем производят по следующей формуле:

где:

A - число подвижных бледных трепонем в контрольной пробирке,

В - число подвижных бледных трепонем в опытной пробирке,

X - процент иммобилизации.

В практической работе процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице N 11 с применением вышеуказанной формулы. Реакция иммобилизации считается отрицательной, когда процент иммобилизации колеблется в пределах 0-20, сомнительной от 21 до 30, слабоположительной от 31 до 50 и положительной выше 50. Сыворотки крови с сомнительными и слабоположительными результатами реакции нуждаются в повторном исследовании для получения более достоверных результатов. Целесообразно также подвергать повторному исследованию все сыворотки крови, давшие полное расхождение результатов с результатами стандартных серологических реакций. Эти сыворотки крови заслуживают особого внимания, так как в этих случаях результаты реакции иммобилизации бледных трепонем дают возможность судить о наличии или отсутствии сифилиса у обследуемого лица.

Определение остаточного комплемента

Определение остаточного комплемента необходимо для суждения о том, достаточным ли было количество комплемента в опытных пробирках, не была ли подвижность бледных трепонем обусловлена отсутствием комплемента, вследствие чего иммобилизины не могли проявить свою активность.

После регистрации результатов реакции иммобилизации бледных трепонем в содержимом пробирок определяют остаточный комплемент добавлением в каждую пробирку гемолитической системы в объеме 0,1 мл. Пробирки помещают в термостат при 37° на 45 минут. В опытных пробирках должен наступить гемолиз эритроцитов, в контрольных должна быть задержка гемолиза. Отсутствие в опытных пробирках гемолиза указывает на недостаточное количество комплемента, в этих случаях исследование надо повторить. Повторное исследование сыворотки крови не производят только в том случае, если отмечена 100% иммобилизация бледных трепонем.

Источники ошибок

Токсичность исследуемой сыворотки крови.

Бактериальное загрязнение исследуемой сыворотки крови, комплемента, среды.

Недостаточное количество комплемента в опыте.

Нарушение герметичности микроанаэростата, проникновение в него кислорода из атмосферного воздуха.

Повышение или понижение температуры в термостате в течение реакции.

Кислотность или щелочность лабораторной посуды, использованной при постановке реакции.

Таблица N 11

Определение процента иммобилизации бледных трепонем

Примечание: Ответ находит в точке пересечения горизонтальной строки с вертикальным столбцом, например: 22 подвижных трепонемы в контрольной пробирке и 8 подвижных трепонем в опытной пробирке соответствует 63% иммобилизации бледных трепонем.