Законодательная база Российской Федерации

"САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1018-01." (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 08.02.2001)

Постановка контроля включает:

- оценку степени диссоциации культуры Е. coli М17-02;

- проверку видовых свойств бактериальных культур;

- проверку способности E.coli К12 F+ StrR, проверку культуры E.coli К12 F+ StrR на однородность и отсутствие загрязнения фагом.

1.5.1. Оценка степени диссоциации культуры E.coli М17-02

Из 18-часовой бульонной культуры делают 10-кратные разведения физиологическим раствором. По 0,1 мл из 5 и 6 разведения засевают на 2 чашки питательного агара, предварительно подсушенные в термостате. Шпателем посевы распределяют по поверхности агара до полного исчезновения влаги и инкубируют в термостате при температуре 37 +/- 1 °C в течение 18 - 24 ч.

Выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 100 колоний.

Проверку тест-штаммов на диссоциацию производят путем визуального просмотра изолированных колоний на чашках в прямом и косонаправленном свете через бинокулярную лупу или микроскоп на малом увеличении.

На питательном агаре бактерии вида E.coli образуют колонии средней величины 3 - 5 мм, плоско-выпуклые, круглые, гладкие с ровным краем (S-форма), влажные, блестящие, прозрачные в прямом и непрозрачные (опалово-мутные) в косопроходящем свете. В косопроходящем свете колонии эшерихий могут иметь равномерную зернистость.

В R-форме колонии эшерихий более плоские, большего размера, неправильной формы с неровными краями и шероховатой, матовой поверхностью.

При наличии диссоциации (по размеру, S-R-диссоциация, др.) подсчитывают количество измененных колоний и общее количество просмотренных колоний. Общее количество просмотренных бактерий не должно быть менее 30. Затем рассчитывают процент диссоциации по формуле:

Если процент диссоциированных колоний более 25%, то данная культура не пригодна для дальнейшего использования.

1.5.2. Контроль видовых свойств E.coli М17-02 и E.соli К12 F+ StrR

После восстановления лиофилизированной культуры проводится типирование культуры по биохимическим свойствам до вида.

Идентификацию рекомендуется проводить с использованием тест-систем биохимической идентификации семейства Enterobacteriaceae, разрешенных к применению. При этом следует руководствоваться рекомендациями производителя. Правомочна постановка отдельных биохимических тестов.

Перед очередным ежеквартальным созданием запаса рабочей культуры оценку эталонного штамма E.coli проводят путем подтверждения следующих основных свойств:

- отсутствие оксидазной активности;

- грам-негативности;

- способности образовывать на среде Эндо характерные темно-красные (малиновые) колонии с металлическим блеском и отпечатком на среде;

- способности утилизировать лактозу до кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 - 48 ч и 44 °С в течение 24 ч;

- способности утилизировать глюкозу до кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 ч.

Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего использования.

1.5.3. Проверка чувствительности E.coli К12 F+ StrR

Способность E.coli К12 F+ StrR лизироваться специфичным фагом является основополагающим свойством тест-культуры, на котором основан метод определения колифагов в воде.

Проверка чувствительности осуществляется каждый раз, когда из запасов хранения берется новая пробирка с рабочей культурой, хранящейся на полужидком агаре.

Выполнение анализа

Бактериальную взвесь готовят по п. 8.5.2.3. На 100 мл расплавленного и остуженного до 45 - 49 °C питательного агара вносят 1 мл бактериальной взвеси и разливают в чашки. После застывания чашки на поверхность агара наносят каплю (0,05 мл) суспензии фага, не захватывая хлороформа. Инкубируют в течение 18 - 24 ч при 37 °C. Просмотр посевов следует осуществлять в проходящем свете.

Культура считается восприимчивой и пригодной для проведения анализов воды при наличии четких зон лизиса. При отсутствии зон лизиса культура не пригодна для использования и подлежит замене.

1.5.4. Проверка культуры E.coli К12 F+ StrR на загрязненность фагом

Бактериальную взвесь готовят по п. 8.5.2.3, вносят в расплавленный и остуженный до температуры 45 - 49 °C питательный агар из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Чашку Петри заливают приготовленной смесью, инкубируют при температуре 37 °C 18 - 24 ч.

Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете. Культура должна давать равномерный газон роста. Наличие зон лизиса в контроле свидетельствует о загрязненности культуры фагами.

1.5.5. Контроль видовых свойств Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens

Оценку эталонного штамма Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens проводят путем подтверждения следующих свойств:

- наличия оксидазной активности;

- грам-негативности;

- роста на ПБ в виде серебристой пленки на поверхности с образованием кольца сине-зеленого пигмента;

- наличия сине-зеленого пигмента пиоцианина при росте на ПА при 37 °C;

- способности роста на питательном агаре при 42 °C в течение 24 ч (для Pseudomonas aeruginosa);

- способности роста на питательном агаре при 4 °С в течение 24 ч (для Pseudomonas fluorescens).

Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего использования.