Законодательная база Российской Федерации

"САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1018-01." (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 08.02.2001)

В качестве контрольных тест-штаммов используют эталонные культуры, полученные из официально признанной коллекции микроорганизмов (п. 4.5).

Хранение запасов рабочей культуры осуществляется в столбике полужидкого агара, срок хранения - 3 мес.

Для целевого использования пригодна суточная ("ночная") культура эталонного штамма, прошедшая не более 2 пассажей на питательных средах с момента высева со среды, для хранения запасов рабочей культуры.

Восполнение запасов рабочей культуры допускается не более трех раз. В этой связи срок использования эталонной культуры с момента вскрытия ампулы - 1 год.

На этапах восстановления из лиофилизированного состояния и восполнения запасов рабочих культур осуществляется контроль сохранения видовых и паспортных свойств тест-культуры.

Культура с измененными свойствами в анализе не используется.

По истечении года необходимо получить новую лиофилизированную эталонную культуру из коллекции микроорганизмов.

Процедура ведения культуры включает следующие этапы:

- восстановление лиофилизированной культуры;

- создание и хранение запасов рабочей культуры;

- восполнение запасов рабочей культуры;

- подготовка культуры для целевого использования в анализе;

- контроль видовых и паспортных свойств.

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70-градусным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят приблизительно 0,5 мл питательного бульона (п. 5.2.1) для регидратации. Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой или шприцем в пробирку с питательным бульоном и инкубируют при 37 +/- 1 °C в течение 18 - 24 ч.

После инкубации из питательного бульона делают высев петлей на скошенный питательный агар в две пробирки (п. 5.3.1).

При восстановлении штамма E.coli K12 F+ StrR посев осуществляется на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин (п. 5.3.5).

Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18 - 24 ч.

Одну пробирку с посевом используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым, паспортным свойствам (п. п. 1.5.2 - 1.5.5 Приложения 2).

Второй посев на скошенном питательном агаре используют для создания запасов рабочей культуры (п. 1.2 Приложения 2).

Оставшуюся бульонную культуру E.coli M17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как это описано в пункте 1.5.1 Приложения 2.

При несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам и (или) при наличии более 25% полиморфных (нетипичных) колоний в R-форме полученную культуру для работы не используют.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов (п. п. 1.5.1 - 1.5.5 Приложения 2) культуру со скошенного питательного агара (для E.coli K12 F+ StrR - с питательного агара со стрептомицином) засевают уколом в столбик с полужидким агаром (п. 5.3.4). В зависимости от интенсивности работы лаборатории посев проводят в 4 - 10 пробирок из расчета по 1 - 3 пробирки на 1 мес. работы и 1 пробирка для восполнения запасов рабочей культуры через 3 мес. на следующий квартал (п. 1.3 Приложения 2).

Посевы инкубируют 18 - 24 ч при 37 °С. При наличии роста пробирки закрывают резиновыми (силиконовыми) пробками и закладывают на хранение при температуре 4 - 8 °C.

Одну из пробирок с культурой, предназначенной для восполнения рабочих запасов, маркируют и хранят отдельно. Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.

Восполнение запасов рабочей культуры производится в конце третьего, шестого и девятого месяца с момента вскрытия ампулы (каждые 3 мес.).

Для восполнения запасов рабочей культуры используется субкультура на среде хранения, полученная ранее при создании запасов или при очередном их восполнении.

Из пробирки с культурой, предназначенной для восполнения запасов, производят посев в питательный бульон. Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 24 ч.

После инкубации из питательного бульона делают высев петлей в две пробирки со скошенным питательным агаром (п. 5.3.1). При ведении штамма E.coli К12 F+ StrR посев осуществляется на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин (5.3.5). Посевы инкубируют при 37 °C 18 +/- 2 ч.

Один из посевов используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым, паспортным свойствам (п. п. 1.5.2 - 1.5.5 Приложения 2).

Второй посев на скошенном питательном агаре используют для восполнения запасов рабочей культуры (п. 1.2 Приложения 2).

Оставшуюся бульонную культуру E.coli М17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как это описано в п. 1.5.1 Приложения 2.

При наличии более 25% полиморфных (нетипичных) колоний и (или) при несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам полученную культуру для дальнейшей работы не используют.

Необходимо получить новую ампулу с эталонной культурой и начать процедуру ведения тестового штамма сначала.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов процедура закладки культуры на хранение осуществляется согласно п. 1.2 Приложения 2.

Восполнение запасов рабочей культуры проводят только три раза.

По истечении года использования необходимо получить новую эталонную культуру из коллекции микроорганизмов.

Накануне использования культуру с полужидкого агара высевают на 2 пробирки со скошенным питательным агаром (п. 5.3.1). Для культуры E.coli К12 F+ StrR используют питательный агар со стрептомицином (п. 5.3.5). Посев инкубируют 18 - 24 ч при 37 °C.

Культуру из одной пробирки используют по назначению. Вторая пробирка с культурой на скошенном питательном агаре используется для получения культуры для работы на следующий (второй) день.

При необходимости получения культуры тест-штамма на третий день высев снова производят с полужидкого агара.

Постановка контроля включает:

- оценку степени диссоциации культуры Е. coli М17-02;

- проверку видовых свойств бактериальных культур;

- проверку способности E.coli К12 F+ StrR, проверку культуры E.coli К12 F+ StrR на однородность и отсутствие загрязнения фагом.

1.5.1. Оценка степени диссоциации культуры E.coli М17-02

Из 18-часовой бульонной культуры делают 10-кратные разведения физиологическим раствором. По 0,1 мл из 5 и 6 разведения засевают на 2 чашки питательного агара, предварительно подсушенные в термостате. Шпателем посевы распределяют по поверхности агара до полного исчезновения влаги и инкубируют в термостате при температуре 37 +/- 1 °C в течение 18 - 24 ч.

Выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 100 колоний.

Проверку тест-штаммов на диссоциацию производят путем визуального просмотра изолированных колоний на чашках в прямом и косонаправленном свете через бинокулярную лупу или микроскоп на малом увеличении.

На питательном агаре бактерии вида E.coli образуют колонии средней величины 3 - 5 мм, плоско-выпуклые, круглые, гладкие с ровным краем (S-форма), влажные, блестящие, прозрачные в прямом и непрозрачные (опалово-мутные) в косопроходящем свете. В косопроходящем свете колонии эшерихий могут иметь равномерную зернистость.

В R-форме колонии эшерихий более плоские, большего размера, неправильной формы с неровными краями и шероховатой, матовой поверхностью.

При наличии диссоциации (по размеру, S-R-диссоциация, др.) подсчитывают количество измененных колоний и общее количество просмотренных колоний. Общее количество просмотренных бактерий не должно быть менее 30. Затем рассчитывают процент диссоциации по формуле:

Если процент диссоциированных колоний более 25%, то данная культура не пригодна для дальнейшего использования.

1.5.2. Контроль видовых свойств E.coli М17-02 и E.соli К12 F+ StrR

После восстановления лиофилизированной культуры проводится типирование культуры по биохимическим свойствам до вида.

Идентификацию рекомендуется проводить с использованием тест-систем биохимической идентификации семейства Enterobacteriaceae, разрешенных к применению. При этом следует руководствоваться рекомендациями производителя. Правомочна постановка отдельных биохимических тестов.

Перед очередным ежеквартальным созданием запаса рабочей культуры оценку эталонного штамма E.coli проводят путем подтверждения следующих основных свойств:

- отсутствие оксидазной активности;

- грам-негативности;

- способности образовывать на среде Эндо характерные темно-красные (малиновые) колонии с металлическим блеском и отпечатком на среде;

- способности утилизировать лактозу до кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 - 48 ч и 44 °С в течение 24 ч;

- способности утилизировать глюкозу до кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 ч.

Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего использования.

1.5.3. Проверка чувствительности E.coli К12 F+ StrR

Способность E.coli К12 F+ StrR лизироваться специфичным фагом является основополагающим свойством тест-культуры, на котором основан метод определения колифагов в воде.

Проверка чувствительности осуществляется каждый раз, когда из запасов хранения берется новая пробирка с рабочей культурой, хранящейся на полужидком агаре.

Выполнение анализа

Бактериальную взвесь готовят по п. 8.5.2.3. На 100 мл расплавленного и остуженного до 45 - 49 °C питательного агара вносят 1 мл бактериальной взвеси и разливают в чашки. После застывания чашки на поверхность агара наносят каплю (0,05 мл) суспензии фага, не захватывая хлороформа. Инкубируют в течение 18 - 24 ч при 37 °C. Просмотр посевов следует осуществлять в проходящем свете.

Культура считается восприимчивой и пригодной для проведения анализов воды при наличии четких зон лизиса. При отсутствии зон лизиса культура не пригодна для использования и подлежит замене.

1.5.4. Проверка культуры E.coli К12 F+ StrR на загрязненность фагом

Бактериальную взвесь готовят по п. 8.5.2.3, вносят в расплавленный и остуженный до температуры 45 - 49 °C питательный агар из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Чашку Петри заливают приготовленной смесью, инкубируют при температуре 37 °C 18 - 24 ч.

Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете. Культура должна давать равномерный газон роста. Наличие зон лизиса в контроле свидетельствует о загрязненности культуры фагами.

1.5.5. Контроль видовых свойств Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens

Оценку эталонного штамма Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens проводят путем подтверждения следующих свойств:

- наличия оксидазной активности;

- грам-негативности;

- роста на ПБ в виде серебристой пленки на поверхности с образованием кольца сине-зеленого пигмента;

- наличия сине-зеленого пигмента пиоцианина при росте на ПА при 37 °C;

- способности роста на питательном агаре при 42 °C в течение 24 ч (для Pseudomonas aeruginosa);

- способности роста на питательном агаре при 4 °С в течение 24 ч (для Pseudomonas fluorescens).

Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего использования.