Законодательная база Российской Федерации

"САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1018-01." (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 08.02.2001)

В качестве эталонного штамма для проведения контроля культуры клеток хозяина при проведении анализа на колифаги используется РНК-содержащий фаг MS2.

Процесс ведения эталонного штамма колифага MS2 состоит из 2 функциональных блоков:

- восстановление лиофилизированной культуры;

- создание запасов эталонной культуры и культур для целевого использования.

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированными культурами нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины.

Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70-градусным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят приблизительно 0,5 мл питательного бульона для регидратации.

Рабочую культуру E.coli К12 F+ StrR, хранящуюся на полужидком агаре, засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевы инкубируют при 37 +/- 1 °C 18 - 24 ч.

После инкубации 0,1 мл полученной бульонной культуры повторно засевают в 3 - 4 пробирки с 10 мл питательного бульона и помещают в термостат при 37 +/- 1 °C. Через 2 ч инкубации в каждую пробирку вносят регидрированную культуру фага MS2, инкубацию продолжают до 18 - 24 ч. После инкубации в пробирку добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, интенсивно встряхивают и оставляют на ночь в холодильнике.

Пипеткой отбирают бульон над осевшим хлороформом и переносят в стерильные пробирки, добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, встряхивают и хранят в холодильнике.

Одну пробирку используют для целевого назначения в контроле чувствительности культуры E.coli К12 F+ StrR к фагу. Две другие служат запасом эталонного фага.

Активность полученной культуры определяется титром фага. Для использования допускается культура с титром более 10 в ст.7 - 10 в ст.8. Через год хранения титр фага может снизиться. В этой связи необходимо получить новую культуру или провести определение титра хранящегося фага.

Для определения титра фага выполняется серия десятикратных разведений культуры фага (п. 2.2). По 1 мл каждого разведения вносят в чашки Петри и заливают смесью питательного агара и E.coli К12 F+ StrR , приготовленной аналогично описанному в п. 1.5.4 Приложения 2. Посевы инкубируют при 37 +/- 1 °C. Пробирки с разведениями закупоривают резиновыми или силиконовыми пробками и хранят до получения результатов при температуре 4 +/- 2 °C для приготовления рабочих суспензий фага.

Через 18 - 24 ч инкубации просчитывают количество бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30 - 100 негативных колоний фага.

При получении титра менее 10 в ст.7 фаг можно размножить. Для нарастания титра необходимо повторить описанную процедуру.

После выполнения работ с культурами фагов необходимо провести тщательную обработку помещения дезсредствами и обеззараживание ультрафиолетовым облучением.