Законодательная база Российской Федерации

"МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЯМ. ГОСТ ИСО 7218-2011" (утв. Приказом Ростехрегулирования от 13.12.2011 N 1477-ст)

При оценке микробиологической безопасности пищевых продуктов и кормов для животных часто недостаточно только знать, какие микроорганизмы присутствуют в образце. В большинстве случаев количественный аспект не менее важен, и это требует необходимости подсчета микроорганизмов. Подсчет можно выполнить различными способами: с помощью прямого определения (микроскопия), посевом на плотные или жидкие питательные среды, с помощью проточной цитометрии. В полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и т. д. Однако в настоящем стандарте рассматривается только подсчет микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

Подсчет на плотных питательных средах основан на способности многих микроорганизмов продуцировать колонии агаровых питательных средах. которые можно распознать невооруженным глазом или с помощью простого увеличительного стекла. Однако, если матрица содержит много частиц, которые могут повлиять на обнаружение колоний, или если количество бактерий очень мало, этот принцип невозможно использовать без первого отделения искомых микроорганизмов из матрицы (например, фильтрацией или иммуноразделением). В таких случаях подсчет с использованием жидких питательных сред является часто оптимальной альтернативой.

Чашка Петри должна быть маркирована этикеткой, на которой указывают номер образца, разведение, дату посева и другую необходимую информацию.

Необходимо выбрать определенные разведения, чтобы обеспечить получение определенного количества колоний на чашках (см. 10.3.1) и преодолеть возможные ингибирующие свойства.

Для переноса каждого разведения используют отдельную стерильную пипетку, кроме случаев, когда работу ведут от самого высокого разведения к самым низким разведениям.

В микробиологии пищевых продуктов обычно используют одну чашку на каждое разведение микро-организмов согласно требованиям ISO/IEC 17025.

В других случаях следует использовать две чашки для каждого разведения в соответствии с ISO 8199.

Отбирают определенные объемы разведений для исследования, касаясь наконечником пипетки боковой стенки пробирки, чтобы удалить избыточную жидкость с внешней стороны пипетки. Поднимают крышку стерильной чашки Петри так, чтобы было возможно внести содержимое пипетки в чашку. Расплавленную агаровую среду выливают при температуре 44 °С - 47 °С в каждую чашку Петри. Необходимо наливать расплавленную среду таким образом, чтобы избежать ее попадания непосредственно в инокулят (посевной материал). Расплавленную среду и инокулят немедленно тщательно перемешивают для получения равномерного распределения микроорганизмов в питательной среде. Далее чашки помещают на горизонтальную поверхность, чтобы дать время охладиться и затвердеть питательной среде (время затвердевания агара не должно превышать 10 мин).

После расплавления агаровой среды, доведенной до необходимого состояния, флакон из водяной бани высушивают сухим чистым полотенцем, чтобы предотвратить загрязнение чашек водой бани. Необходимо следить, чтобы среда не попадала на внешнюю сторону флакона или на внутреннюю часть крышки чашки Петри во время разливки е чашки.

Для этого флакон или колбу необходимо держать фактически в горизонтальном положении и воздержаться от возврата флакона в вертикальное положение между этапами разливки питательной среды.

Если в исследуемом продукте предполагается присутствие колоний (например, виды Proteus) с "ползучим" ростом, используют для анализа слой со стерильным "голодным" агаром или идентичной питательной средой, наносимой на затвердевший агар в чашки с посеянным материалом, чтобы предотвратить или свести к минимуму распространение такого "ползучего" роста.

Методы посева, предназначенные для получения только поверхностных колоний на агаровых чашках, имеют некоторые преимущества по сравнению с методом разливки в чашки для выращивания микроорганизмов внутри агара.

Микроорганизмы не подвергаются действию высокой температуры расплавленной агаровой среды, поэтому количество колоний может быть выше, а подсчет - более точным.

Используют предварительно заполненные агаровой средой чашки, толщина агарового слоя которых составляет не менее 3 мм. Слой агара должен быть ровным и не содержать пузырьков воздуха и поверхностной влаги.

Чтобы облегчить равномерное распределение, поверхность затвердевшего агара необходимо подсушить в соответствии с ISO/TS 11133 или, как определено другим соответствующим международным стандартом. В таком случае посевной материал абсорбируется в течение 15 мин.

С помощью стерильной пипетки пробы жидкого образца (обычно от 0,1 до 0,5 см3) для испытания или исходной суспензии в случае других образцов переносят на агаровую среду в чашки Петри (диаметром 90 или 140 мм соответственно). Этот шаг повторяют для следующего десятичного разведения (колонии, подлежащие подсчету, тогда будут представлены в степени разбавления 10^(-1) в случае материала жидкой пробы и 10^(-2) - в случае материала другой пробы) и. при необходимости, повторяют дальнейшие десятичные разведения.

Если необходимо подсчитать незначительное количество микроорганизмов в случае определенных продуктов, предел обнаружения можно увеличить в десять раз посредством анализа 1.0 см3 пробы в случае жидких продуктов и 1,0 см3 исходной суспензии - в случае других продуктов. Для этой цели. 1,0 см3 посевного материала распределяют или по поверхности большой чашки Петри (диаметром 140 мм), или по поверхностям трех обычных чашек Петри (диаметром 90 мм).

С помощью шпателя, изготовленного из стекла, пластмассы или стали (например, изготовленной из стекла палочки, изогнутой в форме хоккейной клюшки диаметром приблизительно 3,5 мм и длиной 20 см, изгибы выполнены под прямым углом на расстоянии 3 см от одного конца палочки и сплющены на концах с помощью нагревания) распределяют посевной материал по возможности быстро и равномерно по поверхности агара, не касаясь боковых стенок чашки Петри. Закрыв чашку крышкой, дают посевному материалу абсорбироваться в течение 15 мин при комнатной температуре.

В определенных случаях (как указано в соответствующем международном стандарте) посевной материал можно поместить на мембрану и потом распределить по среде, как описано выше.

Метод спирального нанесения посевного материала для определения уровня содержания микро-организмов проверен в межлабораторных испытаниях молока и молочных продуктов и других пищевых продуктов.

Используемое оборудование - спиральный дозатор - описан в 5.24.

Для приготовления чашек с агаровой средой рекомендуется использовать автоматический дозатор со стерильной системой дозирования, чтобы получить чашки с одинаковым объемом агаровой среды.

Во все чашки наливают одинаковое количество агара таким образом, чтобы под дозирующей иглой спирального дозатора высота слоя агара была одинаковой во всех чашках и чтобы угол контакта оставался правильным и одинаковым.

Альтернативно можно использовать готовые агаровые чашки, имеющиеся в продаже.

Обеззараживают кончик дозирующей иглы и трубку, обмакнув их в раствор гипохлорита натрия (см. 5.24.4), а затем в стерильную воду через систему, перед тем как втянуть в дозирующую иглу жидкий образец.

Помещают предварительно разлитую агаровую среду в чашке Петри на поворачивающий столик и опускают дозирующую иглу. Проба распределяется по среде по мере движения кончика иглы по поверхности агаровой среды. Засеянную чашку убирают, а дозирующую иглу возвращают в исходное положение. Иглу обеззараживают и загружают для посева в другие чашки.

После термостатирования на поверхность засеянной агаровой среды помещают специальную сетку для подсчета количества микроорганизмов в чашках, засеянных по спирали. Для определения количества микроорганизмов используют "правило двадцати". Подсчет колоний начинают, выбрав клин и начав подсчет от наружного края первого сегмента по направлению к центру, пока не подсчитают 20 колоний. Процедуру завершают подсчетом в сегменте, содержащем двадцатую колонию. На противоположной стороне чашки подсчитывают соответствующий участок и делят число колоний, подсчитанных по обе стороны, на объем образца, нанесенный на два данных участка. Объемы образца, соответствующие каждой части счетной сетки, приведены в инструкциях, которые прилагаются к каждому спиральному дозатору.

Если в соответствующих стандартах нет специальных оговорок, чашки после посева незамедлительно переворачивают и быстро помещают в термостат с установленной соответствующей температурой. Если происходит интенсивное обезвоживание (например, при 55 °С или в случае интенсивной циркуляции воздуха), чашки перед термостатированием неплотно укладывают в пластиковые пакеты или используют сходную систему равной эффективности.

Во время термостатирования неизбежно происходят незначительные колебания температуры, например во время загрузки и разгрузки термостата, и желательно, чтобы такие периоды занимали минимальное время. Продолжительность таких операций рекомендуется отслеживать, чтобы не допустить их заметного влияния на результат.

Примечание - В определенных случаях, чтобы не спутать частицы исследуемого продукта с колониями микроорганизмов, полезно будет приготовить дубликаты засеянных чашек, которые хранят при температуре (3 ± 2) °С. для последующего сопоставления при подсчете с инкубированными засеянными чашками. Можно также использовать бинокулярное увеличительное стекло, чтобы отличить частицы продукта и колонии микроорганизмов.

В определенных обстоятельствах желательно поместить засеянные чашки в холодильник не более чем на 24 ч перед термостатированием. Если это используется, лаборатория должна гарантировать, что подобная практика не влияет на результат подсчета.

Обычно чашки Петри составляют друг на друга, не более шести штук в стопке при аэробной инкубации. Стопки следует ставить друг от друга и от стенок термостата на расстоянии не менее 25 мм. Однако в термостатах, оснащенных системой циркуляции воздуха, высота стопок может быть больше, а расстояние между ними меньше: однако в этом случае необходимо проверять равномерность распределения температуры в термостате.

После термостатирования чашки следует немедленно исследовать. Однако их можно хранить, если нет иных указаний в соответствующих стандартах, до 48 ч е холодильнике. Хранение в холодильнике в течение более длительных периодов допускается только в случаях, если показано, что оно не влияет на количество искомых микроорганизмов, внешний вид или последующую идентификацию колоний. Охлажденные чашки с некоторыми средами, содержащими индикаторные красители, рекомендуется привести в равновесие с условиями окружающей среды при комнатной температуре перед исследованием, чтобы обеспечить восстановление правильной окраски.

После термостатирования, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания, подсчитывают количество колоний (общее число колоний, число типичных колоний или предполагаемых колоний) на каждой чашке, содержащей менее 300 колоний (или другого количества, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания).

При подсчете типичных или предполагаемых колоний необходимо представить описание колоний, которое дано в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания.

В определенных случаях подсчет колоний может быть затруднен (например, когда присутствуют распространяющие "ползучий рост" микроорганизмы). Такие сливные колонии рассматривают как отдельные колонии. Если менее четверти чашки заполнено таким сливным ростом, колонии подсчитывают на другой части чашки и рассчитывают по их количеству общее количество колоний в чашке. Посредством интерполяции выводится теоретическое число, которое должно соответствовать числу микроорганизмов на всей чашке. Если сливной рост отмечается более чем на одной четверти чашки, то подсчет на такой чашке не проводится. Колонии сливных (распространяющихся) микроорганизмов, выросших в форме цепочек, рассматривают как одну колонию.

В различных методах расчетов, приведенных в 10.3.2. необходимо принять во внимание чашки, не содержащие колоний, если такие чашки имеются.

При использовании спирального дозатора подсчет колоний проводят в соответствии с 10.2.4.3.3.

10.3.2.1 Общие положения

10.3.2.1.1 В этом подразделе рассматриваются общие случаи:

- посев проводят на одной чашке Петри диаметром 90 мм для каждого разведения;

- максимальное количество всех присутствующих колоний на чашке составляет 300;

- максимальное общее число колоний (типичных и атипичных), присутствующих на чашке, при подсчете типичных или презумптивных колоний приблизительно равно 300 на чашку:

- максимальное число колоний для презумптивных колоний равно 150 на чашку;

- число презумптивных колоний, посеянных для идентификации или подтверждения (см. 10.3.2.3), в каждой выбранной чашке обычно 5.

Такие цифры определены в соответствующих стандартах на конкретный метод испытания.

Если используются чашки с другим диаметром, отличным от 90 мм, максимальное число колоний должно возрастать или уменьшаться пропорционально площади поверхности чашки (или мембраны).

10.3.2.1.2 Методы расчета, приведенные ниже, применяются для тех случаев, которые встречаются наиболее часто, когда испытания проводятся в соответствии с установившейся лабораторной практикой. Могут встречаться особые случаи (например, отношение коэффициентов разведения, использованное для двух последующих разведений, может заметно отличаться), и именно поэтому необходимо, чтобы полученные результаты подсчета изучал и трактовал квалифицированный микробиологии, при необходимости, не учитывал недостоверные результаты.

10.3.2.2 Метод расчета: общий случай (подсчет общего количества колоний или типичных колоний). Для получения достоверного результата при подсчете колоний обычно считается необходимым, что бы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 10 колоний [общее число колоний, типичных колоний или колоний, соответствующих критериям идентификации (см. 10.3.2.3)].

Рассчитывают число N микроорганизмов, присутствующих в пробе, как средневзвешенное значение из двух подсчетов последовательных разведений по формуле

N =	C	, (1)
	V x 1,1d

где C - сумма колоний, подсчитанных на двух чашках, выбранных для подсчета из двух последовательных разведений, в которых хотя бы одна чашка содержит не менее 10 колоний:

V - обьем посевного материала, внесенного в каждую чашку, см3;

d - коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d = 1, если выбран только неразведенный жидкий продукт (испытуемая проба без разбавления)].

Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. Если третья цифра меньше пяти, предшествующую цифру не изменяют, если третья цифра больше или равна пяти, увеличивают предшествующую цифру на единицу.

Результат выражают предпочтительно как число от 1,0 до 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени, или целым числом, состоящим из двух значащих цифр.

За результат принимают количество N микроорганизмов на миллилитр (жидких продуктов) или на грамм (прочих продуктов).

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первой выбранном разведении (10^(-2)) 168 колоний:

- во втором выбранном разведении (10'^(-3)) 14 колоний.

N =	C	=	168 + 14	=	182	= 16545
	V x 1,1d		1 x 1,1 x 10^(-2)		0,011

Выполнив округление результатов в соответствии с вышеописанным, получаем число микроорганизмов, равное 17000 или 1,7 х 10^(-3) на миллилитр или на грамм продукта.

10.3.2.3 Метод вычисления:

после проведения идентификации

если используемый метод требует идентификации, определенное количество А предполагаемых колоний (обычно пять) пересеивают с каждой чашки, отобранной для подсчета колоний. После идентификации рассчитывают для каждой чашки число а колоний, соответствующих критерию идентификации, по формуле

где b - число колоний, соответствующих критериям идентификации, среди идентифицированных колоний А.

С - общее число предполагаемых колоний, подсчитанных в чашке.

Результат вычисления округляют до целого числа. Для этого, если первая цифра после запятой меньше пяти, предшествующую цифру не изменяют, если первая цифра после запятой больше или равна пяти, предшествующую цифру увеличивают на единицу.

Количество N идентифицированных микроорганизмов, присутствующих в испытуемой пробе, рассчитывают путем подстановки вместо С значения a в формулу, приведенную в 10.3.2.2.

Полученный результат округляют е соответствии с 10.3.2.2.

Результат выражают в соответствии с 10.3.2.2.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом разведении (10^(-3)): 66 колоний:

- во втором разведении (10^(-4)): 4 колонии.

Тестирование отобранных колоний было выполнено следующим образом:

- из чашки с 66 колониями для идентификации было отобрано восемь колоний, из которых шесть колоний соответствовали критериям, следовательно, а = 50:

- из чашки с четырьмя колониями все четыре соответствовали критериям, следовательно, а = 4.

N =	C	=	50 + 4	=	54	= 49090
	V x 1,1d		1 x 1,1 x 10^(-3)		1,1 x 10^(-3)

Округление результата выполняют в соответствии с 10.3.2.2, количество микроорганизмов в пробе составило 49000 или 4,9 х 10^(4) на миллилитр или на грамм продукта.

10.3.2.4 Метод вычисления: малые количества

10.3.2.4.1 Одна чашка (анализируемой пробы или исходной суспензии или первого разведения) содержит менее десяти колоний.

Число микроорганизмов от десяти до значения верхнего предела каждого метода находится в диапазоне оптимальной точности. Однако точность быстро уменьшается по мере уменьшения числа колоний менее десяти. В зависимости от цели анализа нижний предел можно определить в соответствии с представленным ниже для количеств менее десяти.

Согласно ISO 13843 определение предела обнаружения будет таким: "Наименьшая средняя концентрация частиц х в образце для анализа (навеске), если ожидаемая относительная стандартная неопределенность равна установленному значению (RSD)".

RSD - это относительное квадратное отклонение, которое вычисляют путем деления стандартного отклонения s для популяции образца на среднее х для этого образца. Вместо RSD для относительного стандартного отклонения будет использовано обозначение w. Таким образом,

В случае распределения Пуассона х вычисляют по формуле

Если w установлено при 50 % как предел приемлемой относительной точности (которая считается разумной в микробиологии), нижний предел определения будет при числе колоний, вычисляемых по формуле

Таким образом, результаты, основанные на количестве меньше четырех, следует оценивать как простое выявление присутствия искомого микроорганизма.

Вывод: если в чашке содержится менее десяти колоний, но не менее четырех, результат вычисляют по методу для общего случая (10.3.2.2) и принимают за результат вычисленное количество микроорганизмов х на см3 (для жидких продуктов) или на грамм продукта (для прочих продуктов).

Если общее число составит от одного до трех, точность результата будет слишком низкой, и результат необходимо сообщать следующим образом:

- "Микроорганизмы присутствуют в количестве менее чем (4 х d) на грамм или см3".

10.3.2.4.2 Чашка (анализируемый образец или исходная суспензия или первое разведение) не содержит колоний.

Если чашка с анализируемой пробой (для жидких продуктов) или исходной суспензией (для прочих продуктов) или отобранная из чашек, засеянных материалом первого разведения, не содержит колоний, результат сообщают следующим образом: "Менее 1 / d микроорганизмов на см3" (для жидких продуктов) или "менее 1 / d микроорганизмов на грамм" (для прочих продуктов).

где d - коэффициент разбавления исходной суспензии или первого засеянного или отобранного разведения (d = 10° = 1, если отбирается непосредственно посеянная анализируемая проба жидкого продукта).

10.3.2.4.3 Особые случаи

10.3.2.4.3.1 Общие положения

Эти случаи касаются подсчета типичных и предполагаемых колоний.

10.3.2.4.3.2 Случай 1

Если число типичных и атипичных колоний для чашки с первым разведением d_1, превышает 300 (или какое-либо другое число, установленное в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания) с выявленными типичными колониями или подтвержденными колониями и если чашка, содержащая последующее разведение d_2. содержит менее 300 колоний (или меньше любого другого числа, оговоренного в соответствующем стандарте) и не наблюдается типичных или подтвержденных колоний, результат сообщают следующим образом: "Менее 1 / d, и более 1 / d, микроорганизмов на см3" (для жидких продуктов) или "менее 1 / d_2 и более 1 / d_1, микроорганизмов на г" (для прочих продуктов).

где d_1, и d_2,. - коэффициенты разбавления, соответствующие разведению d_1, и d_2.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^(-2)) выявлено более 300 колоний на чашку, среди которых присутствуют типичные или подтвержденные колонии;

- во втором выбранном разведении (10^(-3)) выявлено 33 колонии, среди которых присутствуют типичные или подтвержденные колонии.

Результат в пересчете на микроорганизмы будет от 100 до1000 на см3 или на г продукта.

10.3.2.4.3.3 Случай 2

Если количество типичных и атипичных колоний в чашке с первым разведением d_1, превышает 300 (или какое-либо другое число, установленное в соответствующем стандарте), среди которых типичных или подтвержденных (идентифицированных) колоний не наблюдается, и если в чашке, содержащей последующее разведение d_2, выявлено менее 300 колоний (или какого-либо другого числа, установленного в соответствующем стандарте) и не выявлено типичных или подтвержденных (идентифицированных) колоний, результат сообщают следующим образом: "Менее М0г микроорганизмов на см3" (для жидких продуктов) или "Менее 1 \ d_2 микроорганизмов на г" (для прочих продуктов).

где d_2 - коэффициент разбавления, соответствующий разведению d_2;.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первой выбранном разведении (10^(-2)) выявлено более 300 колоний на чашку, среди которых нет типичных или подтвержденных колоний;

- во втором выбранном разведении (10^(-3)) 33 колонии, среди которых нет типичных или подтвержденных колоний.

Результат в пересчете на микроорганизмы будет меньше 1000 на см3 или на г продукта.

10.3.2.5 Метод вычисления: особые случаи

10.3.2.5.1 Если число подсчитанных колоний (общее число колоний, число типичных колоний или число предполагаемых колоний) выше 300 (или какого-либо другого числа, установленного в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания) для чашки с первым разведением d_1,. а число (общее, типичных колоний или колоний, соответствующих критериям идентификации) для чашки со вторым последующим разведением d_2 менее 10, то,

- если число колоний для чашки с первым разведением d_1, попадает от 334 до 300 (верхний участок доверительного интервала для средневзвешенного значения, равного 300). используют метод вычисления для общих случаев (см. 10.3.2.2):

- если число колоний на чашке с первым разведением d_1, превышает 334 (верхний предел доверительного интервала для средневзвешенного значения, равного 300). учитывают только результат подсчета для разведения d_2 и вычисляют ориентировочное число (см. 10.3.2.4), за исключением случаев, когда максимальное значение для подсчета колоний установлено на значении 300, а ориентировочное количество меньше восьми (нижний предел доверительного интервала для средневзвешенного значения, равного 10), поскольку разность между двумя разведениями будет неприемлемой.

Цифры, соответствующие доверительным интервалам, должны быть привязаны к максимальному количеству, установленному для подсчета колоний.

Пример 1 - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^(-2)) выявлено 310 колоний:

- во втором выбранном разведении (10^(-3)) выявлено восемь колоний.

Используют метод вычисления для общих случаев, анализируя чашки для двух выбранных разведений.

Пример 2 - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^(-2)) выявлено более 334 колоний на чашку:

- во втором выбранном разведении (10^(-3)) девять колоний.

Ориентировочное число сообщают на основе колоний, подсчитанных в чашке для разведения 10^(-3).

Пример 3 - Подсчет (если для подсчета колоний установлено максимальное количество, равное 300) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^(-2)) свыше 334 колоний на чашку:

- во втором выбранном разведении (10^(-3)) семь колоний. Результат данного подсчета неприемлем.

Пример 4 - Подсчет (если для подсчета колоний установлено максимальное число, равное 150) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^(-2)) более 167 колоний на чашку (верхний предел доверительного интервала при средневзвешенном значении, равном 150):

- во втором выбранном разведении (10^(-3)) семь колоний.

Сообщают ориентировочное количество на основе колоний, подсчитанных в чашке с разведением 10^(-3).

10.3.2.5.2 Если количество подсчитанных колоний (общее количество колоний, количество типичных колоний или количество презумптивных колоний) для каждой из чашек всех посеянных разведений дает значение свыше 300 (или любого другого числа, установленного в соответствующем стандарте), результат формулируют следующим образом: "Более 300 / d" (в случае общего числа или числа типичных колоний) или "Более 300 х b / А x 1 / d" (в случав подтвержденных (идентифицированных) колоний), выраженных в количестве микроорганизмов на см3 (для жидких продуктов) или в количестве микроорганизмов на г (для прочих продуктов).

где d - коэффициент разбавления последнего посеянного разведения;

b - число колоний, соответствующих критериям идентификации среди презумптивных колоний А.

10.3.2.5.3 Если чашка с последним засеянным разведением содержит от 10 до 300 колоний, то общее количество колоний, количество типичных колоний или количество презумптивных колоний N вычисляют по формуле

где с - число колоний, подсчитанных в чашке:

V- обьем посевного материала, использованный для каждой чашки, см3.

d - выбранное разведение (коэффициент разбавления).

Результат округляют в соответствии с 10.3.2.2.

За результат принимают число N микроорганизмов на см3 (для жидких продуктов) или на г (для прочих продуктов).

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в последней засеянном разведении (10^(-4)) 120 колоний.

Округление результата проводят в соответствии с 10.3.2.2. число N микроорганизмов равно 1200000 или 1,2 х 10^5 на см3 или на г продукта.

10.3.2.6 Измерение неопределенности

См. ISO 19036 в отношении количественных определений.

Подсчет колоний дрожжей и плесеней обычно проводят либо методом разливки сред, который позволяет облегчить задачу, либо методом подсчета при поверхностном посеве, который обеспечивает максимальное воздействие на клетки со стороны атмосферного кислорода и позволяет избежать теплового воздействия от расплавленного агара. Предварительно разлитый по чашкам агар перед посевом рекомендуется подсушить (см. ISO/TS 111ЗЗ).

Некоторые дрожжи и плесени могут вызывать инфекционные заболевания или аллергические реакции даже у здоровых людей. В связи с этим необходимо проявлять особую осторожность при работе с ними. Оптимальным вариантом является хранение чашек в термостате, а не в открытом помещении. Крышки с чашек рекомендуется снимать только в случае крайней необходимости, обычно только при приготовлении предметных стекол для исследования под микроскопом. Перед переносом материала прокаленные иглы необходимо остудить, чтобы избежать рассеивания конидий и других клеток. Рабочие столы и термостаты следует регулярно дезинфицировать.

Чашки Петри следует инкубировать в перевернутом положении и не трогать, пока на чашках не вырастет посевной материал для подсчета колоний. Это связано с тем, что перемещение чашек может приводить к освобождению конидий или спор плесени и последующему появлению колоний-спутников, приводя к повышенному подсчету популяции дрожжей и плесени.

Для подсчета берут чашки, содержащие от 10 до 150 колоний. Если флора микроорганизмов состоит преимущественно из плесеней, выбирают чашки, в которых количество колоний ближе к нижней границе интервала: если флора микроорганизмов состоит преимущественно из дрожжей, для подсчета выбирают чашки, в которых количество колоний ближе к верхней границе интервала.

Если идентичность колоний вызывает сомнения, исследуют влажные препараты или окрашенные препараты клеток, не менее пяти колоний на образец, чтобы подтвердить, что бактерии отсутствуют.

Пробы для анализа высевают в жидкую среду, предназначенную для поддержки роста конкретного микроорганизма или группы микроорганизмов и часто-для подавления размножения прочих микроорганизмов.

Чтобы определить, происходит пи рост искомых микроорганизмов, можно использовать различные критерии, например визуальное обследование помутнения, выделение газа, изменение цвета, последующее выделение микроорганизмов на селективной агаризованной среде. Состав питательной среды и критерии для выявления различий положительного и отрицательного результатов опредепены в соответствующих стандартах.

Используя подобный подход, каждый образец для анализа может быть описан только качественно, значение, т. е. результат оценивается как положительный или отрицательный. Чтобы установить количество присутствующих микроорганизмов, необходимо исследовать несколько проб образцов для анализа и использовать статистические методы для определения наиболее вероятного числа (НВЧ = MPN).

Если используют селективную питательную среду, добавление образца для анализа не должно уменьшать селективных свойств этой среды (тем самым способствуя росту прочих микроорганизмов). В большинстве стандартов информация о совместимости определенных образцов и жидкой среды описана в области их применения. Необходимо с осторожностью подходить к таким образцам, как специи, какао, бульон и т. д., поскольку они могут содержать подавляющие рост микроорганизмов вещества, в связи с чем требуют добавления нейтрализующих веществ, применения более высоких коэффициентов разведения, центрифугирования, фильтрования или иммуномагнитной сепарации для выделения искомых микроорганизмов из образца, даже если это специально не оговорено в соответствующих стандартах. Несовместимость может также быть вызвана биологическим составом образца: сильно загрязненные от окружающей среды пробы, ферментированные продукты или продукты, содержащие пробиотики, очевидно, представляют большие проблемы микробиологу-аналитику, чем пробы, которые содержат очень незначительное количество микроорганизмов. Для таких проблемных образцов рекомендуется выполнять эксперименты, используя контрольные микроорганизмы, чтобы подтвердить, что метод действительно подходит для анализа данного образца.

Если в соответствующих стандартах нет иных указаний, объемы образцов для анализа, менее или равные 1 см3, обычно добавляют к объему сред обычной концентрации, в 5 - 10 раз превышающему объем пробы для анализа. Пробы для анализа объемом 1 и 100 см3 обычно добавляют к равным объемам сред двойной концентрации.

Для объемов, превышающих 100 см3, допускается использовать более концентрированные среды. Для особых целей стерильную обезвоженную среду можно растворить в холодном (или предварительно нагретом до 30 °С образце, подлежащем анализу.

Если нет иных указаний, время, прошедшее с момента приготовления первого разведения пробы и момента засева последней пробирки многолуночного планшета или флакона, должно составлять менее 15 мин.

Новую стерильную пипетку следует использовать для каждого разведения.

Сущность метода наиболее вероятного числа (НВЧ) заключается в разбавлении пробы до такой степени, чтобы посевной материал не всегда содержал живые микроорганизмы. По "выходу", т. е. по количеству посевного материала, дающему рост в каждом разведении, будет оцениваться начальная концентрация бактерий в пробе. Чтобы получить оценку в широком диапазоне возможных концентраций, микробиологи используют серийные разведения, инкубируя в термостате по несколько пробирок (или чашек и пр.) каждого разведения. НВЧ (MPN) микроорганизмов, присутствующих на уровне исходной пробы, и точность оценки можно рассчитать с помощью статистических методов на основе числа положительных и отрицательных пробирок, полученных после инкубации в термостате.

Осуществляют выбор НВЧ из различных существующих конфигураций в соответствии.

- с ожидаемым числом микроорганизмов в анализируемой пробе.

- требованиями регламентов.

- требуемой точностью и

- другими практическими проблемами.

Неопределенность измерения зависит от числа положительных образцов для анализа, наблюдаемых практически одинаковым образом, поскольку неопределенность подсчета колоний зависит от числа колоний е чашке. Неопределенность измерения увеличивается как функция корня квадратного из числа использованных пробирок. Число пробирок необходимо увеличить в четыре раза для того, чтобы неопределенность измерения уменьшилась вдвое. Если используют способы только с небольшим числом дублируемых пробирок, неопределенность измерения низкая.

В зависимости от размера образец для анализа можно засевать в пробирки или флаконы, содержащие требуемое количество жидкой среды. Для образцов небольшого объема можно использовать также многолуночные планшеты.

Если ожидаемая концентрация микроорганизмов невелика или ожидается ее умеренное изменение, наиболее подходящим способом посева будет одна серия равных проб для анализа. Там, где ожидаемое соотношение между максимальным и минимальным количеством микроорганизмов менее 25. десять параллельных проб для анализа являются наименьшим числом для работы; для 50 параллельных пробирок соотношение 200 является предельным. Примеры НВЧ для одного разведения приведены в таблицах В.1 - В.4. приложения В.

Если концентрация микроорганизмов в пробе неизвестна или предполагается ее значительное изменение, может потребоваться посев на серии пробирок из нескольких разведений. Высевают достаточное число разведений, чтобы обеспечить исследование как с положительными, так и с отрицательным и результатами. Число разведений также зависит от метода вычисления, используемого для оценки значения НВЧ. Если требуется применение таблиц, то необходимо получить результаты от трех разведений, а способы посева ограничиваются способами, представленными в соответствующих стандартах. При использовании компьютерных программ число разведений и параллельных пробирок не ограничивается.

В наиболее часто применяемом симметричном способе посева для определения НВЧ используют три или пять параллельных пробирок на разведение. Точность, получаемая при применении этого способа, резко уменьшается по мере уменьшения числа пробирок на разведение. Результаты с использованием трех пробирок являются не более чем показателями порядка значения концентрации. Если требуется более высокая точность, рекомендуется использовать пять или больше параллельных пробирок. Примеры определения НВЧ с использованием трех и пяти пробирок приведены соответственно в таблицах В.5 и В.7 приложения В.

В асимметричных способах используют разное количество пробирок в разных разведениях. Применение таких способов пригодно только для оценки количества микроорганизмов в четко заданном диапазоне. Примеры приведены е ISO 8199.

Засеянные пробирки, колбы и флаконы инкубируют в термостате или в водяной бане. Многолуночные планшеты помещают в термостат.

Выбирают продолжительность и температуру инкубации, получив информацию в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания, поскольку эти параметры зависят от типа рассматриваемого микроорганизма или группы микроорганизмов.

Для некоторых микроорганизмов может потребоваться термостатирование в два этапа или этап подтверждения. В отношении подробностей см. соответствующие стандарты.

Критерии дифференциации положительных и отрицательных результатов различны для каждого типа микроорганизма или группы микроорганизмов и определяются в соответствующих стандартах на конкретный метод испытания. Используя эти критерии, подсчитывают и записывают число положительных результатов, полученных во всех образцах для анализа, взятых из одной лабораторной пробы.

Существует три различных варианта определения значения НВЧ: вычисление по математическим формулам, сопоставление с таблицами НВЧ или применение специальных компьютерных программ. При условии, что эти методы основаны на одних и тех же статистических допущениях, все эти варианты равно достоверны. Эти три метода описаны ниже.

10.5.6.1.1 Приблизительные формулы для всех случаев

Приблизительные значения НВЧ для любого числа разведений и параллельных пробирок получают путем применения следующей формулы (взятой из ссылки [36]):

где Z_p - число положительных пробирок:

m_r,- контрольная масса пробы, г,

m_s, - общая масса в граммах, пробы во всех пробирках с отрицательной реакцией, г,

m_t, - общая масса пробы во всех пробирках, г.

НВЧ выражают в пересчете на контрольную массу пробы в граммах (обычно 1 г. иногда 100 г).

10.5.6.1.2 "Точный" раствор для одной серии пробирок

Значение НВЧ для одной серии пробирок выводится по формуле

где m_r, - контрольная масса пробы, г,

m_m - масса пробы в каждой пробирке серии, г.

In - натуральный логарифм:

n - число пробирок в серии:

Z_p-число пробирок с положительным результатом.

10.5.6.1.3 Показатели точности для анализов одного разведения

Пределы доверительного интервала при уровне вероятности 95 %, оценки НВЧ можно рассчитать приблизительно, используя следующую формулу

где х - верхний или нижний предеп 95%-ного доверительного интервала:

m_r,- контрольная масса пробы, г:

m_m - - масса пробы в каждой пробирке серии, г.

In - натуральный логарифм:

n - число пробирок в серии:

Z_n - число пробирок с отрицательной реакцией. Знак "плюс" связан с нижним пределом, а "минус" - с верхним пределом. Приближение не очень хорошее, если большинство пробирок являются отрицательными (стерильными), однако улучшается по мере возрастания доли положительных пробирок.

10.5.6.1.4 Показатели точности симметричных анализов нескольких разведений

log_10 стандартной неопределенности симметричного способа определения НВЧ нескольких разведений можно рассчитать по приближенному равенству Кохрана (Cochran's) [26]

где SE - стандартная ошибка log_10 НВЧ:

f - коэффициент разбавления между последовательными разведениями (обычно 10);

n - число пробирок на разведение.

Верхний и нижний пределы 95%-ного доверительного интервала можно аппроксимировать соответственно умножением и делением НВЧ на антилогарифм 2 х SE. Такое вычисление приводит к завышению верхнего предела.

10.5.6.2.1 Таблицы для одного разведения

Таблицы В.1 - В.4. приложение В, дают значения НВЧ и 95%-ные доверительные интервалы на образец для анализа для 10,15.20 и 25 параллельных пробирок (каждая пробирка засеяна материалом (одного) разведения).

Чтобы подсчитать итог на контрольную массу образца (или объем для жидких образцов), умножают НВЧ и предельные значения 95%-ного доверительного интервала на отношение (контрольная масса [масса пробы для анализа (навески)]). Нельзя умножать на логарифмическую стандартную неопределенность. За контрольную массу в микробиологических исследованиях обычно берется 1 г. Масса образца для анализа (навеска) соответствует количеству образца (в граммах), которое представлено в объеме, использованном для засева пробирок.

Пример - (Ссылка [30]).

Двадцать пробирок с бульоном двойной крепости (концентрации) были засеяны аликвотами по 5 см3 десятикратно разбавленной пробы (0,1 г / 5 см3). После термостатирования 16 пробирок из 20 показали заметный рост. Какова была наиболее вероятная бактериальная плотность (организмов на грамм) в пробе? Таблица В. 3 дает значение 1,61 как наиболее вероятное число (НВЧ) организмов на пробирку при нижнем пределе 95%-ного доверительного интервала, равном 0,93 и верхнем пределе, равном 2.77.

В каждую пробирку было добавлено 5 см3 пробы для анализа, что соответствует 0,5 г пробы. Следовательно, наиболее вероятное число микроорганизмов в 1 г пробы будет задаваться

10.5.6.2.2 Таблицы для нескольких разведений при последовательных разведениях

Для симметричных способов обшей практикой является использование трех последовательных разведений с тремя (таблица В.5) или пятью параллельными пробирками (таблица В.7) в каждом разведении. Записывают число положительных пробирок для каждого набора пробирок и по таблице НВЧ для использованного способа посева подсчитывают наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов, присутствующих в контрольном объеме образца.

Некоторые комбинации положительных пробирок встречаются чаще, чем другие. Например, комбинация положительных пробирок 0, 0, 3 встречается гораздо реже комбинации 3, 2, 1. Чтобы выразить количественно эту вероятность, все комбинации положительных результатов классифицируют по категориям от 0 до 3. Результат категории 1 является результатом с более высокой вероятностью, тогда как результат категории 3 более редкий и его сложно воспроизвести. Наиболее худшим вариантом являются результаты категории 0; эти результаты рекомендуется принимать с большим сомнением. Предполагая, что результаты анализа верны, можно ожидать, что 95 % из наблюдаемых комбинаций попадут в категорию 1. в категорию 2 - 4 %, в категорию 3 - 0,9 % и только 0.1 % - в категорию 0. Категории поясняются в таблице В.6.

В варианте, где используется более трех разведений, выбор "правильной" комбинации трех последовательных разведений не всегда очевиден. Однако выбор можно легко сделать путем записи всех возможных комбинаций положительных пробирок и выбора соответствующей категории по таблице В.5.

После этого применяют следующие правила:

1) Выбирают комбинации трех последовательных разведений, имеющих профиль категории 1, чтобы получить индекс MPN. Если получится более одной комбинации, имеющей профиль категории 1. используют ту комбинацию, которая имеет самое большое число положительных пробирок.

2) Если не имеется комбинации, имеющей профиль категории 1. используют комбинацию, имеющую профиль категории 2. Если имеется несколько комбинаций, имеющих профиль категории 2, используют ту комбинацию, которая имеет самое большое число положительных пробирок.

3) Если не имеется комбинации, имеющей профиль категории 2. используют комбинацию, имеющую профиль категории 3. Если получено несколько комбинаций, имеющих профиль категории 3. используют ту комбинацию, которая имеет самое большое число положительных пробирок.

Некоторые примеры показаны в таблице 1.

Наиболее универсальные компьютерные программы не ставят ограничений относительно числа разведений и параллельных пробирок или симметрии системы НВЧ. Анализатор НВЧ (MPN Assay Analyzer) является доступной программой, разработанной на базе предшествующей (см. ссылку [29]).

10.5.7 Обработка результатов

По индексу НВЧ в таблице В.5 находят (согласно комбинации трех (или пяти) выбранных последовательных разведений) наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов в контрольном объеме.

Результаты представляют как наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов (или специфических групп микроорганизмов) на грамм или на миллилитр. Масса контрольного объема может быть представлена в г или см3 (например. 100 г или 100 см3).