Законодательная база Российской Федерации

"МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЯМ. ГОСТ ИСО 7218-2011" (утв. Приказом Ростехрегулирования от 13.12.2011 N 1477-ст)

Существует три различных варианта определения значения НВЧ: вычисление по математическим формулам, сопоставление с таблицами НВЧ или применение специальных компьютерных программ. При условии, что эти методы основаны на одних и тех же статистических допущениях, все эти варианты равно достоверны. Эти три метода описаны ниже.

10.5.6.1.1 Приблизительные формулы для всех случаев

Приблизительные значения НВЧ для любого числа разведений и параллельных пробирок получают путем применения следующей формулы (взятой из ссылки [36]):

где Z_p - число положительных пробирок:

m_r,- контрольная масса пробы, г,

m_s, - общая масса в граммах, пробы во всех пробирках с отрицательной реакцией, г,

m_t, - общая масса пробы во всех пробирках, г.

НВЧ выражают в пересчете на контрольную массу пробы в граммах (обычно 1 г. иногда 100 г).

10.5.6.1.2 "Точный" раствор для одной серии пробирок

Значение НВЧ для одной серии пробирок выводится по формуле

где m_r, - контрольная масса пробы, г,

m_m - масса пробы в каждой пробирке серии, г.

In - натуральный логарифм:

n - число пробирок в серии:

Z_p-число пробирок с положительным результатом.

10.5.6.1.3 Показатели точности для анализов одного разведения

Пределы доверительного интервала при уровне вероятности 95 %, оценки НВЧ можно рассчитать приблизительно, используя следующую формулу

где х - верхний или нижний предеп 95%-ного доверительного интервала:

m_r,- контрольная масса пробы, г:

m_m - - масса пробы в каждой пробирке серии, г.

In - натуральный логарифм:

n - число пробирок в серии:

Z_n - число пробирок с отрицательной реакцией. Знак "плюс" связан с нижним пределом, а "минус" - с верхним пределом. Приближение не очень хорошее, если большинство пробирок являются отрицательными (стерильными), однако улучшается по мере возрастания доли положительных пробирок.

10.5.6.1.4 Показатели точности симметричных анализов нескольких разведений

log_10 стандартной неопределенности симметричного способа определения НВЧ нескольких разведений можно рассчитать по приближенному равенству Кохрана (Cochran's) [26]

где SE - стандартная ошибка log_10 НВЧ:

f - коэффициент разбавления между последовательными разведениями (обычно 10);

n - число пробирок на разведение.

Верхний и нижний пределы 95%-ного доверительного интервала можно аппроксимировать соответственно умножением и делением НВЧ на антилогарифм 2 х SE. Такое вычисление приводит к завышению верхнего предела.

10.5.6.2.1 Таблицы для одного разведения

Таблицы В.1 - В.4. приложение В, дают значения НВЧ и 95%-ные доверительные интервалы на образец для анализа для 10,15.20 и 25 параллельных пробирок (каждая пробирка засеяна материалом (одного) разведения).

Чтобы подсчитать итог на контрольную массу образца (или объем для жидких образцов), умножают НВЧ и предельные значения 95%-ного доверительного интервала на отношение (контрольная масса [масса пробы для анализа (навески)]). Нельзя умножать на логарифмическую стандартную неопределенность. За контрольную массу в микробиологических исследованиях обычно берется 1 г. Масса образца для анализа (навеска) соответствует количеству образца (в граммах), которое представлено в объеме, использованном для засева пробирок.

Пример - (Ссылка [30]).

Двадцать пробирок с бульоном двойной крепости (концентрации) были засеяны аликвотами по 5 см3 десятикратно разбавленной пробы (0,1 г / 5 см3). После термостатирования 16 пробирок из 20 показали заметный рост. Какова была наиболее вероятная бактериальная плотность (организмов на грамм) в пробе? Таблица В. 3 дает значение 1,61 как наиболее вероятное число (НВЧ) организмов на пробирку при нижнем пределе 95%-ного доверительного интервала, равном 0,93 и верхнем пределе, равном 2.77.

В каждую пробирку было добавлено 5 см3 пробы для анализа, что соответствует 0,5 г пробы. Следовательно, наиболее вероятное число микроорганизмов в 1 г пробы будет задаваться

10.5.6.2.2 Таблицы для нескольких разведений при последовательных разведениях

Для симметричных способов обшей практикой является использование трех последовательных разведений с тремя (таблица В.5) или пятью параллельными пробирками (таблица В.7) в каждом разведении. Записывают число положительных пробирок для каждого набора пробирок и по таблице НВЧ для использованного способа посева подсчитывают наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов, присутствующих в контрольном объеме образца.

Некоторые комбинации положительных пробирок встречаются чаще, чем другие. Например, комбинация положительных пробирок 0, 0, 3 встречается гораздо реже комбинации 3, 2, 1. Чтобы выразить количественно эту вероятность, все комбинации положительных результатов классифицируют по категориям от 0 до 3. Результат категории 1 является результатом с более высокой вероятностью, тогда как результат категории 3 более редкий и его сложно воспроизвести. Наиболее худшим вариантом являются результаты категории 0; эти результаты рекомендуется принимать с большим сомнением. Предполагая, что результаты анализа верны, можно ожидать, что 95 % из наблюдаемых комбинаций попадут в категорию 1. в категорию 2 - 4 %, в категорию 3 - 0,9 % и только 0.1 % - в категорию 0. Категории поясняются в таблице В.6.

В варианте, где используется более трех разведений, выбор "правильной" комбинации трех последовательных разведений не всегда очевиден. Однако выбор можно легко сделать путем записи всех возможных комбинаций положительных пробирок и выбора соответствующей категории по таблице В.5.

После этого применяют следующие правила:

1) Выбирают комбинации трех последовательных разведений, имеющих профиль категории 1, чтобы получить индекс MPN. Если получится более одной комбинации, имеющей профиль категории 1. используют ту комбинацию, которая имеет самое большое число положительных пробирок.

2) Если не имеется комбинации, имеющей профиль категории 1. используют комбинацию, имеющую профиль категории 2. Если имеется несколько комбинаций, имеющих профиль категории 2, используют ту комбинацию, которая имеет самое большое число положительных пробирок.

3) Если не имеется комбинации, имеющей профиль категории 2. используют комбинацию, имеющую профиль категории 3. Если получено несколько комбинаций, имеющих профиль категории 3. используют ту комбинацию, которая имеет самое большое число положительных пробирок.

Некоторые примеры показаны в таблице 1.

Наиболее универсальные компьютерные программы не ставят ограничений относительно числа разведений и параллельных пробирок или симметрии системы НВЧ. Анализатор НВЧ (MPN Assay Analyzer) является доступной программой, разработанной на базе предшествующей (см. ссылку [29]).

10.5.7 Обработка результатов

По индексу НВЧ в таблице В.5 находят (согласно комбинации трех (или пяти) выбранных последовательных разведений) наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов в контрольном объеме.

Результаты представляют как наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов (или специфических групп микроорганизмов) на грамм или на миллилитр. Масса контрольного объема может быть представлена в г или см3 (например. 100 г или 100 см3).