Законодательная база Российской Федерации

12.1 Общие положения

Для биохимического и серологического подтверждений используют только чистые культуры.

Стандартные методы подтверждения описаны в соответствующих нормативных документах. В качестве альтернативы биохимическим методам, приведенным в этих стандартах, методы подтверждения, указанные в данном разделе (биохимические наборы, нуклеиновые пробы), следует использовать в условиях, указанных также в данном разделе, если они особо не оговорены в соответствующих стандартах.

12.2 Приготовление чистой культуры

Приготовление чистых культур начинают с выделения одной колонии в агаровой среде. Затем выделенную колонию пересевают на неселективную агаровую среду. После инкубации в термостате выделяют хорошо изолированную колонию для последующих подтверждающих испытаний. При необходимости посев колонии повторяют.

Желательно выполнять идентификацию, используя клетки одной колонии. Если в одной колонии недостаточно количества клеточного материала, материал вначале рекомендуется посеять в жидкую среду или на косой агар (косяк), после чего можно использовать субкультуру для выполнения испытаний.

12.3 Окрашивание по Граму (модифицированный метод Хаккера)

12.3.1 Общие положения

Данный способ окрашивания бактериальных клеток позволяет описать морфологию бактерий и разделить их на две группы по тому, способны они или нет сохранять цвет кристаллического фиолетового (грамположительные Грам +) в условиях испытания. Результаты такого деления, главным образом, вытекают из различий в структуре клеточных стенок двух групп, что коррелирует с другими основными различиями между двумя группами.

Удовлетворительной альтернативой окрашивания по Граму является использование 3%-ного раствора гидроокиси калия (КОН). Полную петлю выросшей культуры бактерий перемешивают в двух каплях раствора КОН. Грамотрицательные (Грам -) бактерии станут причиной увеличения вязкости и слизистости раствора в течение 30 с, так что смесь тянется за бактериологической петлей при поднятии петли.

Существует несколько приемов выполнения окрашивания по Граму, но все они соответствуют последовательности, приведенной 12.3.2.

12.3.2 Растворы

12.3.2.1 Общие положения

Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые растворы. В таком случае следуют рекомендациям изготовителя.

12.3.2.2 Раствор кристаллического фиолетового

12.3.2.2.1 Состав:

кристаллический фиолетовый - 2,0 г,

этиловый спирт (95 %) - 20 см3,

оксалат аммония (C2H8N2О4) -0,8 г,

вода - 80 см3.

12.3.2.2.2 Приготовление

Растворяют кристаллический фиолетовый в этиловом спирте, а оксалат аммония - в дистиллированной воде. Смешивают эти два раствора и оставляют смесь на 24 ч до использования.

12.3.2.3 Раствор йода

12.3.2.3.1 Состав:

йод-1,0 г;

йодистый калий (KI) - 2,0 г;

вода-100 см3.

12.3.2.3.2 Приготовление

Йодистый калий растворяют в 10 см3 воды и добавляют крапинки йода. После растворения доводят до 100 см3 в мерной колбе.

12.3.2.4 Раствор сафранина

12.3.2.4.1 Состав:

сафранин - 0,25 г;

этиловый спирт (95 %) - 10 см3;

вода - 100 см3.

12.3.2.4.2 Приготовление

Растворяют сафранин в этиловом спирте, затем смешивают с дистиллированной водой.

12.3.3 Техника окрашивания

После фиксации на предметном стекле бактериального мазка, приготовленного из 18 - 24-часовой культуры или мутного бульона, заливают мазок раствором кристаллического фиолетового. Оставляют на 1 мин для осуществления реакции.

Стекло под наклоном осторожно промывают в течение нескольким секунд водой.

Наносят на стекло раствор йода. Оставляют на 1 мин для осуществления реакции.

Стекло под наклоном осторожно промывают водой в течение нескольких секунд.

Стекло в наклонном положении осторожно и непрерывно промывают этанолом (95 %) в течение не более 30 с до прекращения вымывания фиолетового красителя.

Стекло в наклонном положении осторожно промывают водой для удаления этилового спирта. Наносят на стекло раствор сафранина и оставляют на 10 с. Стекло под наклоном осторожно промывают водой.

Высушивают стекло.

12.3.4 Оценка результатов

Окрашенный мазок просматривают под микроскопом, используя для этого светосильный объектив с масляной иммерсией. Бактериальные клетки, окрашенные в синий или фиолетовый цвет, относят к грамположительным (Грам +); другие, окрашенные в цвета от темно-розового до красного, относят к грамотрицательным (Грам -).

У чистых культур некоторых типов бактерий в поле микроскопа могут присутствовать как грамположительные, так и грамотрицательные клетки.

Примечание - Плотные скопления клеток могут давать нетипичную картину окрашивания.

12.4 Использование биохимических наборов для идентификации

Можно использовать имеющиеся биохимические наборы для идентификации изолированных колоний.

Проверяют пригодность биохимических наборов, как показано в ходе оценочных исследований, опубликованных в международной научной литературе, касающейся предпочтительно микробиологии пищевых продуктов <*>. Такая проверка особенно важна, если изготовитель не имеет данных об адекватности своих наборов.

---

<1> Запросы об информации следует направлять в национальные, региональные или международные справочные центры, указанные для каждого микроорганизма.

Лаборатория должна получить сертификат контроля на каждую партию с указанием испытанных штаммов.

Изготовитель должен также определить контрольные штаммы, которые лаборатория может использовать для проверки сохранности характеристик биохимических наборов.

Наборы должны включать, как минимум, биохимические тесты, описанные в соответствующих стандартах, или к ним должны прилагаться другие тесты.

12.5 Применение нуклеиновых зондов для идентификации

Имеющиеся а настоящее время нуклеиновые зонды можно использовать для идентификации изолированных колоний.

Необходимо проверить, чтобы нуклеиновые зонды, используемые для идентификации, были пригодны, как показывают оценочные исследования, опубликованные в международной научной литературе, предпочтительно касающейся микробиологии пищевых продуктов. Такая проверка особенно важна, если изготовитель не предоставляет данных об адекватности этих зондов.

Лаборатория должна получить сертификат контроля на каждую партию с указанием испытанных штаммов.

Изготовитель должен также определить контрольные штаммы, которые лаборатория может использовать для проверки сохранности характеристик биохимических наборов.

12.6 Серологические методы12.6.1 Общие положения

Если необходима серологическая идентификация, ее выполняют после биохимической идентификации изолированных колоний.

12.6.2 Реакция агглютинации на предметном стекле

Реакция антиген-антитело вызывает слипание бактериальных клеток и образование рыхлых масс или плотных гранул. В случае бактерий семейства Enterobacteriaceae реакция между "Н" (т. е. флагеллярным) антигеном и гомологичной антисывороткой дает рыхлое слипание, тогда как реакция с участием "О" (т. е. соматического) антигена дает более плотное слипание в гранулы.

Перед реакцией агглютинации с антисыворотками рекомендуется выполнить тест, чтобы определить, агглютинируют ли бактериальные клетки в растворе хлорида натрия (3 % (по массе)). Если бактериальные клетки агглютинируют, штамм является склонным к аутоагглютинации и его не следует использовать в реакции агглютинации.

Имеющиеся в продаже готовые антисыворотки бывают двух типов:

поливалентная антисыворотка, которая реагирует с микроорганизмами конкретного вида или с группами сероваров (серотипов бактериальной клетки) и которая пригодна для предварительной идентификации:

специфичные моноклональные антитела, применение которых позволит идентифицировать конкретный серовар.

Лаборатория должна получить сертификат контроля качества на каждую партию антисыворотки с указанием контрольных штаммов.

Проверяют, чтобы реакция агглютинации на предметном стекле удовлетворяла требованиям данной задачи, как показывают оценочные исследования, опубликованные в международной научной литературе, преимущественно касающейся микробиологии пищевых продуктов <1>.

---

<1> Запросы об информации следует направлять в национальные, региональные или международные справочные центры, указанные для каждого микроорганизма.

При использовании реактивов рекомендуется использовать положительный и отрицательный контроли, удовлетворяющие условиям реакции.

12.6.3 Реакция латекс-агглютинации

Более быстрый метод можно выполнить с имеющимися в продаже наборами, с применением частиц латекса, покрытых специфичными для группы бактерий антителами (например, для Escherichia coli О157 см. стандарт ISO 16654 или Staphylococcus aureus в ISO 6888). Антиген в экстракте испытывают против ряда латексных реактивов.

Проверяют, чтобы агглютинация на латексе удовлетворяла требованиям данного исследования, что подтверждено в оценочных исследованиях, описанных в международной научной литературе и преимущественно связанных с микробиологией пищевых продуктов.

Лаборатория должна получить сертификат контроля качества на каждую партию с указанием штаммов.

При использовании реактивов следует использовать положительный и отрицательный контроли. удовлетворяющие условиям реакции.