Законодательная база Российской Федерации

"МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЯМ. ГОСТ ИСО 7218-2011" (утв. Приказом Ростехрегулирования от 13.12.2011 N 1477-ст)

Пробы для анализа высевают в жидкую среду, предназначенную для поддержки роста конкретного микроорганизма или группы микроорганизмов и часто-для подавления размножения прочих микроорганизмов.

Чтобы определить, происходит пи рост искомых микроорганизмов, можно использовать различные критерии, например визуальное обследование помутнения, выделение газа, изменение цвета, последующее выделение микроорганизмов на селективной агаризованной среде. Состав питательной среды и критерии для выявления различий положительного и отрицательного результатов опредепены в соответствующих стандартах.

Используя подобный подход, каждый образец для анализа может быть описан только качественно, значение, т. е. результат оценивается как положительный или отрицательный. Чтобы установить количество присутствующих микроорганизмов, необходимо исследовать несколько проб образцов для анализа и использовать статистические методы для определения наиболее вероятного числа (НВЧ = MPN).

Если используют селективную питательную среду, добавление образца для анализа не должно уменьшать селективных свойств этой среды (тем самым способствуя росту прочих микроорганизмов). В большинстве стандартов информация о совместимости определенных образцов и жидкой среды описана в области их применения. Необходимо с осторожностью подходить к таким образцам, как специи, какао, бульон и т. д., поскольку они могут содержать подавляющие рост микроорганизмов вещества, в связи с чем требуют добавления нейтрализующих веществ, применения более высоких коэффициентов разведения, центрифугирования, фильтрования или иммуномагнитной сепарации для выделения искомых микроорганизмов из образца, даже если это специально не оговорено в соответствующих стандартах. Несовместимость может также быть вызвана биологическим составом образца: сильно загрязненные от окружающей среды пробы, ферментированные продукты или продукты, содержащие пробиотики, очевидно, представляют большие проблемы микробиологу-аналитику, чем пробы, которые содержат очень незначительное количество микроорганизмов. Для таких проблемных образцов рекомендуется выполнять эксперименты, используя контрольные микроорганизмы, чтобы подтвердить, что метод действительно подходит для анализа данного образца.

Если в соответствующих стандартах нет иных указаний, объемы образцов для анализа, менее или равные 1 см3, обычно добавляют к объему сред обычной концентрации, в 5 - 10 раз превышающему объем пробы для анализа. Пробы для анализа объемом 1 и 100 см3 обычно добавляют к равным объемам сред двойной концентрации.

Для объемов, превышающих 100 см3, допускается использовать более концентрированные среды. Для особых целей стерильную обезвоженную среду можно растворить в холодном (или предварительно нагретом до 30 °С образце, подлежащем анализу.

Если нет иных указаний, время, прошедшее с момента приготовления первого разведения пробы и момента засева последней пробирки многолуночного планшета или флакона, должно составлять менее 15 мин.

Новую стерильную пипетку следует использовать для каждого разведения.

Сущность метода наиболее вероятного числа (НВЧ) заключается в разбавлении пробы до такой степени, чтобы посевной материал не всегда содержал живые микроорганизмы. По "выходу", т. е. по количеству посевного материала, дающему рост в каждом разведении, будет оцениваться начальная концентрация бактерий в пробе. Чтобы получить оценку в широком диапазоне возможных концентраций, микробиологи используют серийные разведения, инкубируя в термостате по несколько пробирок (или чашек и пр.) каждого разведения. НВЧ (MPN) микроорганизмов, присутствующих на уровне исходной пробы, и точность оценки можно рассчитать с помощью статистических методов на основе числа положительных и отрицательных пробирок, полученных после инкубации в термостате.

Осуществляют выбор НВЧ из различных существующих конфигураций в соответствии.

- с ожидаемым числом микроорганизмов в анализируемой пробе.

- требованиями регламентов.

- требуемой точностью и

- другими практическими проблемами.

Неопределенность измерения зависит от числа положительных образцов для анализа, наблюдаемых практически одинаковым образом, поскольку неопределенность подсчета колоний зависит от числа колоний е чашке. Неопределенность измерения увеличивается как функция корня квадратного из числа использованных пробирок. Число пробирок необходимо увеличить в четыре раза для того, чтобы неопределенность измерения уменьшилась вдвое. Если используют способы только с небольшим числом дублируемых пробирок, неопределенность измерения низкая.

В зависимости от размера образец для анализа можно засевать в пробирки или флаконы, содержащие требуемое количество жидкой среды. Для образцов небольшого объема можно использовать также многолуночные планшеты.

Если ожидаемая концентрация микроорганизмов невелика или ожидается ее умеренное изменение, наиболее подходящим способом посева будет одна серия равных проб для анализа. Там, где ожидаемое соотношение между максимальным и минимальным количеством микроорганизмов менее 25. десять параллельных проб для анализа являются наименьшим числом для работы; для 50 параллельных пробирок соотношение 200 является предельным. Примеры НВЧ для одного разведения приведены в таблицах В.1 - В.4. приложения В.

Если концентрация микроорганизмов в пробе неизвестна или предполагается ее значительное изменение, может потребоваться посев на серии пробирок из нескольких разведений. Высевают достаточное число разведений, чтобы обеспечить исследование как с положительными, так и с отрицательным и результатами. Число разведений также зависит от метода вычисления, используемого для оценки значения НВЧ. Если требуется применение таблиц, то необходимо получить результаты от трех разведений, а способы посева ограничиваются способами, представленными в соответствующих стандартах. При использовании компьютерных программ число разведений и параллельных пробирок не ограничивается.

В наиболее часто применяемом симметричном способе посева для определения НВЧ используют три или пять параллельных пробирок на разведение. Точность, получаемая при применении этого способа, резко уменьшается по мере уменьшения числа пробирок на разведение. Результаты с использованием трех пробирок являются не более чем показателями порядка значения концентрации. Если требуется более высокая точность, рекомендуется использовать пять или больше параллельных пробирок. Примеры определения НВЧ с использованием трех и пяти пробирок приведены соответственно в таблицах В.5 и В.7 приложения В.

В асимметричных способах используют разное количество пробирок в разных разведениях. Применение таких способов пригодно только для оценки количества микроорганизмов в четко заданном диапазоне. Примеры приведены е ISO 8199.

Засеянные пробирки, колбы и флаконы инкубируют в термостате или в водяной бане. Многолуночные планшеты помещают в термостат.

Выбирают продолжительность и температуру инкубации, получив информацию в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания, поскольку эти параметры зависят от типа рассматриваемого микроорганизма или группы микроорганизмов.

Для некоторых микроорганизмов может потребоваться термостатирование в два этапа или этап подтверждения. В отношении подробностей см. соответствующие стандарты.

Критерии дифференциации положительных и отрицательных результатов различны для каждого типа микроорганизма или группы микроорганизмов и определяются в соответствующих стандартах на конкретный метод испытания. Используя эти критерии, подсчитывают и записывают число положительных результатов, полученных во всех образцах для анализа, взятых из одной лабораторной пробы.

Существует три различных варианта определения значения НВЧ: вычисление по математическим формулам, сопоставление с таблицами НВЧ или применение специальных компьютерных программ. При условии, что эти методы основаны на одних и тех же статистических допущениях, все эти варианты равно достоверны. Эти три метода описаны ниже.

10.5.6.1.1 Приблизительные формулы для всех случаев

Приблизительные значения НВЧ для любого числа разведений и параллельных пробирок получают путем применения следующей формулы (взятой из ссылки [36]):

где Z_p - число положительных пробирок:

m_r,- контрольная масса пробы, г,

m_s, - общая масса в граммах, пробы во всех пробирках с отрицательной реакцией, г,

m_t, - общая масса пробы во всех пробирках, г.

НВЧ выражают в пересчете на контрольную массу пробы в граммах (обычно 1 г. иногда 100 г).

10.5.6.1.2 "Точный" раствор для одной серии пробирок

Значение НВЧ для одной серии пробирок выводится по формуле

где m_r, - контрольная масса пробы, г,

m_m - масса пробы в каждой пробирке серии, г.

In - натуральный логарифм:

n - число пробирок в серии:

Z_p-число пробирок с положительным результатом.

10.5.6.1.3 Показатели точности для анализов одного разведения

Пределы доверительного интервала при уровне вероятности 95 %, оценки НВЧ можно рассчитать приблизительно, используя следующую формулу

где х - верхний или нижний предеп 95%-ного доверительного интервала:

m_r,- контрольная масса пробы, г:

m_m - - масса пробы в каждой пробирке серии, г.

In - натуральный логарифм:

n - число пробирок в серии:

Z_n - число пробирок с отрицательной реакцией. Знак "плюс" связан с нижним пределом, а "минус" - с верхним пределом. Приближение не очень хорошее, если большинство пробирок являются отрицательными (стерильными), однако улучшается по мере возрастания доли положительных пробирок.

10.5.6.1.4 Показатели точности симметричных анализов нескольких разведений

log_10 стандартной неопределенности симметричного способа определения НВЧ нескольких разведений можно рассчитать по приближенному равенству Кохрана (Cochran's) [26]

где SE - стандартная ошибка log_10 НВЧ:

f - коэффициент разбавления между последовательными разведениями (обычно 10);

n - число пробирок на разведение.

Верхний и нижний пределы 95%-ного доверительного интервала можно аппроксимировать соответственно умножением и делением НВЧ на антилогарифм 2 х SE. Такое вычисление приводит к завышению верхнего предела.

10.5.6.2.1 Таблицы для одного разведения

Таблицы В.1 - В.4. приложение В, дают значения НВЧ и 95%-ные доверительные интервалы на образец для анализа для 10,15.20 и 25 параллельных пробирок (каждая пробирка засеяна материалом (одного) разведения).

Чтобы подсчитать итог на контрольную массу образца (или объем для жидких образцов), умножают НВЧ и предельные значения 95%-ного доверительного интервала на отношение (контрольная масса [масса пробы для анализа (навески)]). Нельзя умножать на логарифмическую стандартную неопределенность. За контрольную массу в микробиологических исследованиях обычно берется 1 г. Масса образца для анализа (навеска) соответствует количеству образца (в граммах), которое представлено в объеме, использованном для засева пробирок.

Пример - (Ссылка [30]).

Двадцать пробирок с бульоном двойной крепости (концентрации) были засеяны аликвотами по 5 см3 десятикратно разбавленной пробы (0,1 г / 5 см3). После термостатирования 16 пробирок из 20 показали заметный рост. Какова была наиболее вероятная бактериальная плотность (организмов на грамм) в пробе? Таблица В. 3 дает значение 1,61 как наиболее вероятное число (НВЧ) организмов на пробирку при нижнем пределе 95%-ного доверительного интервала, равном 0,93 и верхнем пределе, равном 2.77.

В каждую пробирку было добавлено 5 см3 пробы для анализа, что соответствует 0,5 г пробы. Следовательно, наиболее вероятное число микроорганизмов в 1 г пробы будет задаваться

10.5.6.2.2 Таблицы для нескольких разведений при последовательных разведениях

Для симметричных способов обшей практикой является использование трех последовательных разведений с тремя (таблица В.5) или пятью параллельными пробирками (таблица В.7) в каждом разведении. Записывают число положительных пробирок для каждого набора пробирок и по таблице НВЧ для использованного способа посева подсчитывают наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов, присутствующих в контрольном объеме образца.

Некоторые комбинации положительных пробирок встречаются чаще, чем другие. Например, комбинация положительных пробирок 0, 0, 3 встречается гораздо реже комбинации 3, 2, 1. Чтобы выразить количественно эту вероятность, все комбинации положительных результатов классифицируют по категориям от 0 до 3. Результат категории 1 является результатом с более высокой вероятностью, тогда как результат категории 3 более редкий и его сложно воспроизвести. Наиболее худшим вариантом являются результаты категории 0; эти результаты рекомендуется принимать с большим сомнением. Предполагая, что результаты анализа верны, можно ожидать, что 95 % из наблюдаемых комбинаций попадут в категорию 1. в категорию 2 - 4 %, в категорию 3 - 0,9 % и только 0.1 % - в категорию 0. Категории поясняются в таблице В.6.

В варианте, где используется более трех разведений, выбор "правильной" комбинации трех последовательных разведений не всегда очевиден. Однако выбор можно легко сделать путем записи всех возможных комбинаций положительных пробирок и выбора соответствующей категории по таблице В.5.

После этого применяют следующие правила:

1) Выбирают комбинации трех последовательных разведений, имеющих профиль категории 1, чтобы получить индекс MPN. Если получится более одной комбинации, имеющей профиль категории 1. используют ту комбинацию, которая имеет самое большое число положительных пробирок.

2) Если не имеется комбинации, имеющей профиль категории 1. используют комбинацию, имеющую профиль категории 2. Если имеется несколько комбинаций, имеющих профиль категории 2, используют ту комбинацию, которая имеет самое большое число положительных пробирок.

3) Если не имеется комбинации, имеющей профиль категории 2. используют комбинацию, имеющую профиль категории 3. Если получено несколько комбинаций, имеющих профиль категории 3. используют ту комбинацию, которая имеет самое большое число положительных пробирок.

Некоторые примеры показаны в таблице 1.

Наиболее универсальные компьютерные программы не ставят ограничений относительно числа разведений и параллельных пробирок или симметрии системы НВЧ. Анализатор НВЧ (MPN Assay Analyzer) является доступной программой, разработанной на базе предшествующей (см. ссылку [29]).

10.5.7 Обработка результатов

По индексу НВЧ в таблице В.5 находят (согласно комбинации трех (или пяти) выбранных последовательных разведений) наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов в контрольном объеме.

Результаты представляют как наиболее вероятное число (НВЧ) микроорганизмов (или специфических групп микроорганизмов) на грамм или на миллилитр. Масса контрольного объема может быть представлена в г или см3 (например. 100 г или 100 см3).