Законодательная база Российской Федерации

"БЕЗОПАСНОСТЬ РАБОТЫ С МИКРООРГАНИЗМАМИ I-II ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ. САНИТАРНЫЕ ПРАВИЛА И НОРМЫ. СП 1.2.011-94" (утв. Постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 04.05.94 N 011)

1. Бактериологический контроль работы стерилизаторов проводят после монтажа и ремонта аппаратуры, а также в процессе его эксплуатации (плановый - 2 раза в год и при получении неудовлетворительных результатов контроля).

Контроль эффективности работы стерилизаторов осуществляют бактериологическим методом, используя биотесты на основании гибели спор тест-культуры. Биотесты представляют собой флаконы из трубки стеклянной для лекарственных средств ФИ/1-5 нс 1 ТУ 64-0709-10-88 (инсулиновые флаконы) или чашечки из алюминиевой фольги (диск размером 14 мм с луночкой-вдавление от неоточенного края карандаша), содержащие высушенные споры тест-культуры Вас. stearothermophilus ВКМ В-718, помещенные в пакеты из упаковочной бумаги (ОСТ 42-21-2-85). Упаковочные тесты нумеруют и размещают в контрольные точки паровых стерилизаторов (5-10 тестов). По окончании стерилизации биотесты подвергают бактериологическому исследованию.

2. Штамм Вас. stearothermophilus ВКМ В-718 подвижная термофильная палочка, по Граму окрашивается положительно, культивируется при температуре 55 +- 1°С, исключающей развитие других широко распространенных микроорганизмов. Споры овальные, расположенные центрально. На мясопептонном бульоне (рН 7,3 +- 0,1) через 24 часа образует помутнение среды, на мясо-пептонном агаре (рН 7,3 +- 0,1) - слабо выпуклые колонии диаметром 2-4 мм с ровным краем. Штамм непатогенен для человека и животных. Штамм получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов, хранится в музее культур НИИ профилактической токсикологии и дезинфекции (117246 г.Москва, Научный проезд, 18).

Приготовление биотеста

В ампулу с лиофилизированной культурой вносят 0,2 мл. стерильной водопроводной воды и оставляют в течение 30 минут при комнатной температуре.

Одну-две капли культуры засевают в 2 пробирки с бульоном (МПБ, Хоттингера, питательный сухой) с 0,5% глюкозы. Суточную культуру засевают на пробирки скошенного агара (Хоттингера, мясопептонный, сухой питательный). Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы со скошенным картофельнопептонным агаром. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды, инкубируют при 55° в течение 10-12 суток в наклонном положении агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой. На 7, 10 и 12 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования. Достаточным количеством считают 80-90 % спор в поле зрения. Культуру смывают стерильной дистиллированной водой. В целях освобождения от вегетативных клеток суспензию прогревают на водяной бане при температуре 65-70° в течение 30 мин, центрифугируют трехкратно с частотой вращения 33, 33 с - 1 (2000 об/мин) по 15 минут, промывая осадок стерильной дистиллированной водой после каждого центрифугирования. Отмытые споры суспендируют в стерильной дистиллированой воде в соотношении 1 : 1 по объему. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4°С в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками (срок хранения 2 года).

Чистоту культуры на всех этапах культивирования контролируют высевом на агаровые пластинки.

Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной суспензии

- 7

десятикратно разводят до 10 стерильной дистиллированной водой, высевая

-5 -7

на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл ориентировочно из 10 -10 ) (предел разведения зависит от титра полученных спор). Посевы инкубируют в течение 48 часов, проводят подсчет выросших колоний. Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее арифметическое число колоний с учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

Пример расчетов. Предположим, что при посеве на три чашки Петри с

-5

агаром суспензия в разведении 1:100000 (10 ), подсчитано 140, 110 и 134

-6

колонии. Аналогичные высевы из разведений 10 привели к образованию

-7

12 ,14 и 16 колоний; из 10 - 5, 3 и 7 колоний. Вычисляем общее число колоний, а затем среднее количество колоний для каждого разведения 128, 14 и 5

Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем титр жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведения, далее находим среднее арифметическое число колоний:

Таким образом, титр исходной суспензии составит:

Исходная суспензия должна содержать не менее

вносят из исходной суспензии с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329-81) в 0,02 мл в носители (стерильные инсулиновые флакончики с ватно-марлевой пробкой или чашечки из алюминиевой фольги, разложенные в чашки Петри), подсушивают в термостате при 37° или в эксикаторе над осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 часов. Для определения фактической обсемененности исследуют не менее 3-х биотестов от каждой группы. Во флаконы (чашечки) вносят по 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги, отмывают в широкогорлых пробирках с бусами в 10 мл) и встряхивают в течение 10 минут на аппарате для встряхивания жидкостей с последующим высевом на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл суспензии из трех последовательных десятикратных разведений.

3. Определение устойчивости спор тест-культур к действию водяного насыщенного пара под избыточным давлением проводят при температуре 120 +- 2°С.

Биотесты в упаковочной бумаге помещают в стерилизационной коробке в камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопаровой камере

2

0,11+0,01 МПа (1,1+0,1 кгс/см ) проводят продувку парового стерилизатора (вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора) в течение 10 минут при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от

2

0,01 до 0,02 МПа (от 0,1 до 0,2 кгс/см ).

2

После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до 0,11 +- 0,01 МПа (1,1 +- 0,1 кгс/см ) температура 120+-2°С и через 5 минут (времени выживания спор тест-культуры) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем давления проводят максимум в течение 8 минут, спуск - в течение 3 минут. Аналогичное исследование проводят в течение 15 минут времени выдержки (время гибели спор тест-культуры).

Контроль температуры осуществляют максимальным термометром. По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и проводят бактериологическое исследование. Партию биотестов считают годными для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры соответствуют вышеописанным требованиям.

4. Для определения эффективности работы стерилизатора в обеззараженные биотесты и контрольный (без стерилизации) стерильно вносят по 5 мл питательной среды, инкубируют при 55 °С в течение 7 суток при ежедневном просмотре посевов, делая высевы на агаровые пластинки, из проросших емкостей.

При использовании полусинтетической среды с индикатором феноловым красным рост тест-культуры определяют по изменению красного цвета среды (рН 7,7 +- 0,1 на желто-оранжевый (рН 6,7 +- 0,1) за счет разложения глюкозы с образованием кислоты. В целях исключения ложного отрицательного результата (при наличии роста тест-культуры отсутствует изменение цвета питательной среды) флаконы (пробирки) должны быть плотно закрыты стерильными резиновыми пробками (N 7,5; 12,5). Отсутствие роста тест-культуры указывает на эффективность работы стерилизатора.

Рост других культур микроорганизмов относят за счет вторичного обсеменения. При наличии роста тест-штаммов проводится повторный контроль на удвоенном количестве биотестов. Если и при повторной проверке тест-культуры не инактивируются осуществляют тщательный контроль технического состояния аппарата и контрольно-измерительных приборов. При отсутствии роста тест-культур в контрольном биотесте (не подвергшемся стерилизации) устанавливается причина (нежизнеспособность тест-культуры, несоблюдение методики приготовления биотестов, питательных сред, условий культивирования).

5. Для спорообразования используют:

- картофельнопептонный агар (пептон - 5,0, мел - 1,0, агар - 25,0, картофельная вода - 1000 мл, рН 7,1 +- 0,1. Сырой картофель (200 г очищенного картофеля на 1 л водопроводной воды) тщательно моют, очищают от кожуры и глазков, нарезают мелкими ломтиками, заливают водопроводной водой и кипятят 30 мин. после закипания (молодой картофель употреблять нельзя). Отвар отстаивают и фильтруют в холодном состоянии через ватно-марлевый фильтр. Доводят объем фильтрата до первоначального. Устанавливают рН 7,1 +- 0,1 Добавляют пептон и агар. Нагревают, помешивая до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего добавляют мел. Разливают по флаконам, стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. После стерилизации среду во флаконах скашивают; - пшеничный агар (пшеничная крупа "Артек" или "Полтавская" - 500,0 , агар - 25,0 , дистиллированная вода - 1000 мл), рн 7,3 +- 0,1.

Пшеничную крупу "Артек" ("Полтавская") заливают дистиллированной водой. Через 12 часов настой аккуратно сливают, не выжимая, доводят до первоначального объема, добавляют агар и растапливают на водяной бане или в автоклаве (текучим паром 1 час). Остывший агар выкладывают на противень и срезают осадок. Агар растапливают на водяной бане, постоянно помешивая. Устанавливают рН 7,3 +- 0,1. Разливают во флаконы. Стерилизуют текучим паром по 1 часу в течение 3 суток. После стерилизации среду скашивают.

6. Для контроля используют бульон Хоттингера рН 7,3, агар Хоттингера РН 7,3, питательный бульон сухой рН 7,1 (Дагестанский НИИ питательных сред) , питательный агар сухой рН 7,3 (Дагестанский НИИ питательных сред), среда питательная для контроля стерильности сухая (предприятие Центрального НИИВС им.И.М.Мечникова) рН 7,0, бульон из перевара кровяных сгустков, полусинтетическая среда с индикатором феноловым красным РН 7,7 (аммоний фосфорно-кислый однозамещенный - NH40H2P04 - 1,0 г; магний серно-кислый MgSО - 0,2 г, калий хлористый - КС1 - 0,2 г, 4 глюкоза - 5.0 г, феноловый красный - 0,02 г, бульон Хоттингера с содержанием аминного азота - 140-160 мг % - 200 мл, дистиллированная вода - 800 мл, рН 7,7 +- 0,1. Компоненты смешивают и растворяют при нагревании на водяной бане, доводят рН до 7,7 +- 0,1, разливают во флаконы, стерилизуют при 110°С в течение 30 минут).

Приложение 5.7.
(Обязательное)