Законодательная база Российской Федерации

"ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

В системе противохолерных мероприятий значительное место занимает бактериологический анализ, от правильности и своевременности проведения которого зависит характер и объем профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Исследования проводят с целью:

- выявления больных холерой и вибриононосителей;

- установления окончательного диагноза при вскрытии трупов лиц, умерших от подозрительного на холеру заболевания;

- обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;

- бактериологического контроля эффективности лечения больных холерой и вибриононосителей;

- бактериологического контроля объектов окружающей среды, в том числе поверхностных водоемов;

- бактериологического контроля эффективности обеззараживания в очаге инфекции.

Материалом для бактериологического анализа могут служить испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил, гидробионты, сточные воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты, мухи и др.

Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного учреждения немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками. Руководитель является ответственным за правильность отбора, хранения и своевременность доставки проб в лабораторию.

Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных вибрионов к дезинфицирующим средствам и кислотам, возможность антагонистического действия сопутствующей микрофлоры и предполагаемую концентрацию возбудителя в исследуемом материале. Если в материале от больных алгидной формой холеры концентрация возбудителя достигает 10(6) - 10(9) м.к./мл, то в испражнениях больных легкой формой и леченных антибиотиками, реконвалесцентов и носителей количество холерных вибрионов обычно не превышает 10(2) - 10(4) м.к./г.

Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не содержащую следов дезинфицирующих растворов. Стерилизацию посуды и других средств забора материала проводят автоклавированием, сухим жаром или кипячением в 2%-м растворе пищевой соды.

Материал для исследования должен быть доставлен не позже чем через 2 ч после его взятия. В случае удлинения сроков доставки используют транспортные среды. Наиболее удобной и достаточно эффективной является 1%-я пептонная вода (рН 8,4 +/- 0,1).

В пептонную воду в качестве ингибитора сопутствующей флоры может быть добавлен теллурит калия из расчета 1:100000 - 1:200000 или моющее средство "Прогресс" в концентрации 0,1 - 0,2%. В отдельных случаях для транспортирования материала могут быть использованы солевые консерванты (см. раздел 7).

На флаконах (пробирках) с пептонной водой, передаваемых в стационары для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с указанием названия среды и даты ее приготовления.

Среды во флаконах или пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, рекомендуется хранить не более 2-х суток при температуре не выше (10,0 +/- 0,2) °С при условии сохранения их стерильности. Целесообразно обеспечение стационаров и групп забора проб средами в закатанных флаконах.

При наличии у больного диареи материал забирают до начала этиотропной терапии в количестве 10 - 20 мл, у больных легкими формами - 1 - 2 г испражнений. От больных тяжелой формой материал направляют в лабораторию нативным и в 1%-й пептонной воде. В транспортную среду вносят 1 - 2 мл или 1 - 2 г материала на 5 - 6 мл среды.

При вынужденном удлинении сроков доставки материала в лабораторию (длительное плавание, круиз и т.п.) можно использовать полоски фильтровальной (промокательной) бумаги. Жидкими испражнениями пропитывают полоску обычной плотной промокательной бумаги или другого гигроскопичного материала и герметично упаковывают в пластиковый пакет для предохранения от высыхания при транспортировании в лабораторию. На таких полосках холерные вибрионы выживают до четырех - пяти или более недель, пока сохраняется влага.

При обследовании на вибриононосительство материал забирает медицинский персонал лечебно-профилактических учреждений, в очаге создают специальные группы по отбору проб, работающие под руководством эпидемиологов.

Материал в количестве 1 - 2 г может быть доставлен на исследование нативным, в 1%-й пептонной воде или другой транспортной среде.

5.1.1. Способы отбора проб от больных холерой, вибриононосителей и контактных с ними лиц секционного материала

Испражнения и рвотные массы в количестве 10 - 20 мл собирают в стерильную посуду стерильными ложками или стеклянными трубками с резиновой грушей из индивидуального судна, на дно которого помещают меньший по размеру сосуд (лоток), удобный для обеззараживания кипячением.

Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом можно использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в прямую кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения стекают в сосуд свободно или при легком массаже брюшной стенки.

Стерильный ректальный ватный тампон из гигроскопической ваты вводят в прямую кишку на глубину 5 - 6 см, собирают им содержимое со стенок кишечника и опускают во флакон или пробирку с 1%-й пептонной водой.

Стандартную стерильную петлю из алюминиевой проволоки перед забором материала смачивают стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида и вводят в прямую кишку на 5 - 6 см. Взятый материал переносят во флакон или пробирку с 1%-й пептонной водой.

Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Материал доставляют нативным.

От умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной около 10 см) верхней, средней и нижней частей тонкой кишки, разрез производят между двойными лигатурами, предварительно наложенными на оба конца изымаемого участка кишечника. Желчный пузырь после перевязки протока извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь от трупа можно взять стерильным шприцем с толстой иглой в объеме до 10 мл и перенести в емкость с 1%-й пептонной водой. Взятые образцы органов трупа укладывают раздельно в стерильные банки.

Банки, пробирки с материалом закрывают непромокаемыми пробками и пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь. Все пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для транспортирования металлическую тару и перевозят на служебном транспорте с сопровождающим. Форма направления дана в Прилож. 1.

5.1.2. Отбор проб из объектов окружающей среды

Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой.

Из водопроводных кранов пробы воды берут после предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 мин. при полном открытии крана.

Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя способами: в объеме 1 л в двух емкостях по 500 мл или тампонами, приготовленными из марлевых салфеток размером 10 х 10 см, сложенных в 10 - 15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды, через сутки помещают в стерильную банку и доставляют в лабораторию.

Гидробионтов (рыб, лягушек и др.) отлавливают из водоемов любым способом и в закрытых банках, ведрах и других сосудах доставляют в лабораторию.

Ил и фитопланктон (водоросли) также помещают в стерильные банки и транспортируют в лабораторию.

Исследовать зоопланктон (дафнии, циклопы и др.) можно групповым методом, объединяя в один посев 10 - 30 образцов, отловленных на одном участке водоема. В этом случае они могут быть доставлены в одном сосуде. При исследовании рыб берут содержимое желудка и жабры.

Смывы с различных объектов окружающей среды берут ватным или марлевым тампоном, смоченным 0,9%-м раствором натрия хлорида, с поверхности площадью 10 х 10 см. Тампон опускают во флакон или пробирку с 1%-й пептонной водой.

Для сбора мух расставляют мухоловки, в которые наливают 1%-ю пептонную воду с 1% сахара.

Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают по 200 г плотных и 0,5 л жидких, помещают в стеклянную посуду и закрывают. При необходимости в жидкие продукты добавляют основной пептон до 1%-й концентрации.

Пробы объектов окружающей среды этикетируют, заполняют направление (Прилож. 2) и отправляют в лабораторию с нарочным согласно действующим СП.

Перечень предметов, входящих в укладки для отбора проб, см. в Прилож. 3, 4.

При бактериологическом исследовании на холеру используют различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной агар, элективные дифференциально-диагностические среды и набор сред для идентификации.

Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие номера госрегистрации и лицензии, или среды, консерванты, приготовленные по рецептуре и технологии, изложенной в разделе 7. Используемые для диагностики холеры питательные среды подлежат бактериологическому контролю в установленном порядке.

Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) °С.

Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в 1%-й пептонной воде 6 - 8 ч, в пептонной воде с теллуритом калия - 12 - 18 ч, на щелочном агаре - не менее 14 - 16 ч, а на плотных элективных средах - 18 - 24 ч. Теллурит калия следует добавлять в 1%-ю пептонную воду с рН не ниже 8,3 +/- 0,1 до внесения исследуемого материала. Продолжительность хранения рабочего раствора теллурита калия (1:1000) - 7 дней, а питательных сред с теллуритом калия - не более 2-х суток при условии содержания их в холодильнике.

5.2.1. Исследование проб от больных и вибриононосителей секционного материала (рис. 1)

Рис. 1. Схема лабораторного исследования на холеру

I этап

Испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое кишечника, желчного пузыря и суспензию кусочков слизистой тонкого кишечника трупа в объеме 0,5 - 1,0 мл засевают пипеткой в 50 - 100 мл накопительной среды, петлей - на щелочной агар и одну из элективных сред (СЭДХ, TCBS).

При исследовании материала от больных с подозрением на заболевание холерой не допускается использование в качестве накопительной среды 1%-й пептонной воды с теллуритом калия.

В случае поступления материала от больных с подозрением на холеру могут быть использованы ускоренные методы исследования: иммуно-люминесцентный, иммобилизация и ПЦР со специфическими праймерами (см. раздел 6) на первом, втором и последующих этапах исследования.

Материал от подозреваемых на вибриононосительство засевают в 50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл - при групповых, объединяя в один флакон по 0,5 - 1,0 мл пробы не более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких случаях при проведении массовых обследований на вибриононосительство.

Материал, доставленный в 5 мл 1%-й пептонной воды, полностью используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1%-й пептонной воды во флаконе, и доставки его не позже 2-х ч после забора пробы, флакон помещают в термостат на 6 ч для накопления возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл 1%-й пептонной воды.

В отдельных случаях при бактериологическом исследовании материала от лиц, принимавших антибиотики, активные по отношению к возбудителю холеры, его засевают в 200 - 300 мл 1%-й пептонной воды (предпочтительно в широкогорлые колбы) и на 2 чашки щелочного агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч, производя последовательные высевы через 8 - 10 ч инкубации с поверхностного слоя среды на пластинки щелочного агара. Использование второй среды обогащения в этом варианте исследования нецелесообразно.

II этап (через 6 - 8 ч от начала исследования)

С первой среды накопления делают высев на щелочной агар и одну из элективных сред и в 5 - 8 мл второй среды накопления. Пересевы в жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой бактериологической петлей диаметром 5 мм.

При отрицательных результатах исследования нативного материала ускоренными методами их повторяют после 6 ч инкубации первой среды накопления.

III этап (через 12 - 16 ч от начала исследования)

Высев со второй среды накопления на щелочной агар.

В случае необходимости ускорения хода анализа материала от больного, подозрительного на заболевание холерой, отбор колоний со щелочного агара, засеянного в начале исследования, можно начинать уже на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.

IV этап (через 18 - 24 ч от начала исследования)

Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й накопительных сред.

а) Чашки с посевами просматривают в проходящем свете невооруженным глазом или с помощью лупы, а также (особенно в вечернее и ночное время) под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете и отбирают подозрительные на вибрионы колонии для выделения и идентификации культуры.

На щелочном агаре колонии холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские, голубоватые, гомогенные, с ровными краями, прозрачные в проходящем свете и светло-серые с голубым или зеленоватым оттенком под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете (Прилож. 5).

Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ имеют ярко-желтую окраску на зеленом или синем фоне среды, полупрозрачные. Размеры колоний на щелочном агаре через 10 - 12 ч инкубации обычно не превышают 1 мм, а к 18 - 24 ч достигают 2 - 3 мм в диаметре. Темпы формирования колоний холерных вибрионов на элективных средах несколько замедлены, поэтому просмотр посевов на СЭДХ или TCBS следует проводить не ранее чем через 18 - 20 ч инкубации, когда размеры их становятся близки к колониям, вырастающим на щелочном агаре.

В отдельных случаях в посевах могут также встречаться атипичные колонии: мутные с плотным центром, пигментированные (коричневые или светло-желтые), мельчайшие коккоподобные, шероховатые. Следует иметь в виду, что состав и качество питательных сред оказывают влияние на величину и плотность колоний холерных вибрионов, а также на морфологию клеток.

б) При отборе колоний можно использовать пробу на индофенолоксидазу с однокомпонентным реактивом (без альфа-нафтола) с индикаторными бумажками из набора СИБ-1 для идентификации вибрионов или - тест-системы ОКСИ-тест. С колониями, обнаруженными на элективных средах, пробу на оксидазу ставить не рекомендуется.

в) Подозрительные колонии проверяют в слайд-агглютинации с сывороткой холерной О1 в разведении 1:50 - 1:100. При положительной реакции и достаточном количестве подозрительных колоний ставят слайд-агглютинацию с вариантоспецифическими сыворотками Инаба и Огава в том же разведении, приготавливают мазки для окраски по Граму и обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. При отрицательных результатах колонии, обнаруженные в посевах материала от больных, проверяют в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О139 и РО.

Положительная ориентировочная реакция агглютинации с холерной О1 сывороткой в разведении 1:100 и вариантоспецифической в разведении 1:50 или положительная реакция с флюоресцирующими иммуноглобулинами в сочетании с морфологическими, культуральными признаками и специфической иммобилизацией позволяют выдать на соответствующем этапе предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного вибриона О1, а в случае положительной реакции с сывороткой О139 - холерного вибриона О139 серогруппы.

г) Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не агглютинирующиеся холерными О1 и О139 сыворотками, отсевают на одну из полиуглеводных сред (лактозо-сахарозная, Ресселя, Клиглера, маннозо-сахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки щелочного агара для выделения чистой культуры, ее идентификации и определения чувствительности к антибиотикам.

V этап (через 24 - 36 ч от начала исследования)

Отбор культур для идентификации.

На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичными для вибрионов характером роста и изменениями:

- на двууглеводных средах (лактозо-сахарозная, глюкозо-лактозная и Клиглер) наблюдается характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа, а также сероводорода, продуцируемого в среде Клиглера, отдельными штаммами за счет расщепления серосодержащих компонентов;

- в маннозо-сахарозной среде за счет ферментации обоих углеводов окрашиваются и столбик, и скошенная часть, а также в отдельных случаях улавливается образование сероводорода.

Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие индофенолоксидазы.

Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах, с помощью окрашенных по Граму мазков.

Культуры, дающие характерные изменения на полиуглеводных средах и положительные в пробе на оксидазу, проверяют в ориентировочной слайд-агглютинации с холерными сыворотками О1 в разведении 1:100, РО, Инаба и Огава - в разведении 1:50. При отрицательных результатах с этими сыворотками ставят слайд-агглютинацию с холерной сывороткой О139 серогруппы, используя ее в соответствии с инструкцией по применению.

На основании положительных результатов агглютинации с сыворотками О1, Инаба или/и Огава выдают предварительный положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры холерного вибриона О1 соответствующего серовара.

Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой О139 при отрицательных результатах с сыворотками О1 серогруппы, выдают ответ о выделении холерного вибриона О139 серогруппы.

Проводят идентификацию выделенных на полиуглеводных средах или на щелочном агаре агглютинирующихся и не агглютинирующихся сыворотками О1, РО или О139 серогрупп оксидазопозитивных культур по сокращенной или полной схеме, не агглютинирующихся холерными О1, РО и О139 сыворотками - до определения вида с учетом основных родовых признаков.

VI этап (через 36 - 48 ч от начала исследования)

Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы и биовара.

Для холерных вибрионов О1 эпидемическую значимость ориентировочно оценивают по тестам гемолитической активности и чувствительности к фагам эльтор ctx+ и ctx-, а в специализированных учреждениях - окончательно по результатам ПЦР или генетического зондирования на присутствие в геноме выделенной культуры ctx AB (А) гена, а также токсигенности на модели кроликов-сосунков. Эпидемическую значимость холерных вибрионов О139 серогруппы определяют по тем же тестам, кроме чувствительности к фагам эльтор ctx+ и ctx-. К окончанию этого этапа исследования должна быть определена антибиотикочувствительность выделенной культуры.

При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками О1 и О139, выдают ответ о выделении холерных вибрионов не О1 и не О139. При наличии вибрионных агглютинирующих диагностических сывороток определяют принадлежность к другим серогруппам (О2 - О83).

Идентификацию культур, агглютинирующихся РО-сывороткой, см. в разделе 5.3.

5.2.2. Исследование объектов окружающей среды

Схема анализа объектов окружающей среды отличается от схемы исследования материала от больных только на I этапе, II - VI этапы изложены выше.

а) Вода поверхностных водоемов и водопроводная

В зависимости от времени доставки пробы возможны следующие варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов:

- к исследуемой воде добавляют раствор основного пептона до 1%-й концентрации, определяют рН, в случае необходимости подщелачивают 10%-м раствором едкого натрия до рН 8,4 +/- 0,1. Время инкубации в 1-й среде накопления - 8 - 10 ч. Объем 2-й среды накопления - 10 мл; время инкубации в среде без теллурита калия - 6 ч, а с теллуритом калия - 18 - 20 ч;

- в исследуемую воду добавляют раствор основного пептона до 1%-й концентрации и теллурит калия из рабочего разведения 1:1000 до концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с данными проверки. Устанавливают рН 8,4 +/- 0,1. Время инкубации 18 - 24 ч; вторая среда накопления - 10 мл среды без теллурита калия, время инкубации 6 - 8 ч;

- исследование проб воды можно также проводить с использованием в качестве ингибитора посторонней флоры моющего средства "Прогресс" в концентрации 0,1 - 0,2%; после добавления основного раствора пептона до 1%-й концентрации и установления щелочной реакции пробы сохраняют при комнатной температуре (не выше 25 °С) до утра (первая среда накопления). В начале следующего дня засевают 5 мл поверхностного слоя в 100 мл 1%-й пептонной воды (вторая среда накопления) и делают высев на щелочной агар; высев со второй среды накопления производят через 6 - 8 ч инкубации;

- воду фильтруют через мембранные фильтры N 2 или 3, смыв с которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из смыва с фильтра можно делать мазки для окраски флюоресцирующими холерными иммуноглобулинами, а также ставить РНГА, ПЦР со специфическими праймерами.

При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно использовать III среду накопления.

б) Хозяйственно-бытовые сточные воды

Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через бумажный или матерчатый фильтр для освобождения от механических примесей (при необходимости).

После добавления к пробам основного раствора пептона до 1%-й концентрации устанавливают рН 8,4 +/- 0,1 и инкубируют в объемах по 500 мл 8 - 10 ч (1 среда накопления) или с добавлением теллурита калия 1:100000 (1:200000) - 18 - 24 ч.

При заборе сточных вод марлевыми тампонами последние помещают в широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл) и далее исследуют, как указано выше.

в) Гидробионты

Лягушку непосредственно перед исследованием обездвиживают уколом иглы в спинной мозг и фиксируют на препаровальной доске брюшком вверх. Поверхность брюшка обрабатывают спиртом и ножницами делают медиальный разрез. Желчный пузырь отсекают от печени, разрезают и делают отпечаток на пластинке щелочного агара. Остатки желчи вместе с желчным пузырем помещают во флаконы с 50 - 100 мл 1%-й пептонной воды. Содержимое желудка засевают в 1%-ю пептонную воду, а внутренней поверхностью стенки делают отпечатки на агаровые пластинки. Посев кишечника делают таким же образом, отсекая несколько петель в верхнем, среднем и нижнем отделах кишечника.

У крупных рыб в том же порядке засевают в накопительную среду содержимое желчного пузыря, желудка, кишечника и жабры. Мелких рыб (мальков) измельчают ножницами по 10 - 20 экз. в одной пробе и делают посев суспензии петлей на чашку с агаром и в 1%-ю пептонную воду.

Дафний, циклопов и других рачков, так же, как и фитопланктон, растирают в ступке и засевают петлей в 1%-ю пептонную воду.

У раков исследуют кишечник и жабры, делая посев содержимого в среду накопления и слизистой стенки - отпечатком на агаровую среду.

г) Пищевые продукты

Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.

Молоко в количестве 5 мл сеют в 50 - 100 мл среды накопления или к 0,5 л молока добавляют основной раствор пептона до 1%-й концентрации его в молоке. Другие молочные продукты (кефир, сметану, творог, мороженое и т.д.) в количестве 5 - 10 мл засевают в 1%-ю пептонную воду.

Из твердых пищевых продуктов берут навеску 25 г, растирают в стерильной ступке с 2 - 3 г кварцевого песка и физиологическим раствором, а затем переносят в 125 мл накопительной среды и петлей на агаровые среды.

Масло засевают в жидкую среду накопления в количестве 5 - 10 г, размягчив его в термостате, или делают посев смыва с поверхности его кусков.

После посева продукта устанавливают рН среды 8,4 +/- 0,1.

д) Смывы с объектов внешней среды и мух засевают в 1%-ю пептонную воду и исследуют по обычной схеме.

5.2.3. Порядок исследования в условиях односменной работы лаборатории

При осуществлении эпиднадзора за холерой исследование материала от обследуемых контингентов может выполняться в следующих вариантах.

а) В качестве 1-й или 2-й среды накопления используют 1%-ю пептонную воду (рН 8,4 +/- 0,1) с теллуритом калия в конечной концентрации 1:100000 - 1:200000 в соответствии с результатами его контроля.

Вопрос выбора транспортной среды и порядок исследования решают в зависимости от разницы времени с момента взятия пробы до поступления ее в лабораторию. Примерная схема забора материала от больных в 1%-ю пептонную воду и порядок дальнейшего его исследования на холеру с учетом различного времени доставки в лабораторию представлены в табл. 1. В течение рабочей недели для отбора проб используют 1%-ю пептонную воду без теллурита калия в объеме 5 - 10 мл, во флаконах или пробирках (транспортная среда).

Пробы до отправки в лабораторию сохраняют при комнатной температуре (24,0 +/- 1,0) °С в биксах, ящике, шкафу и т.д. в специально выделенной комнате, закрывающейся на замок. Продолжительность сохранения проб в указанных условиях - до 24 ч.

В случаях, когда температура в помещении превышает 25 °С, материал следует брать в 1%-ю пептонную воду с теллуритом калия.

В лаборатории в пробы во флаконах доливают соответствующую среду накопления до 50 мл, а из пробирок все 5 - 10 мл транспортной среды с материалом переносят пипеткой в 50 мл среды накопления.

На период выходного дня лаборатории в порядке исключения допускается следующий вариант: забор материала в 50 мл 1%-й пептонной воды с теллуритом калия (транспортная среда); допускаемое время сохранения проб до начала исследования при температуре (20,0 +/- 1,0) °С - 60 ч, (27,0 +/- 3,0) °С - 48 ч. В лаборатории 5 - 10 мл поверхностного слоя среды с материалом переносят в 50 мл 1%-й пептонной воды без теллурита калия (1 среда накопления) и делают высев на чашку щелочного агара с дальнейшим исследованием по изложенной схеме.

б) Пептонную воду повышенной щелочности в качестве накопительной среды рекомендуется использовать только на первом этапе исследования с удлинением срока инкубации ее до 18 - 24 ч. Основной раствор пептона и 1%-ю пептонную воду с рН 9,5 +/- 0,5 можно готовить впрок по общепринятой методике с подщелачиванием до необходимого уровня и последующей стерилизацией при температуре 120 °С - 20 мин.

Для подщелачивания пептонной воды используют 10 - 20% NaOH.

Таблица 1

ПОРЯДОК ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВРЕМЕНИ ОТБОРА И ДОСТАВКИ ЕГО В ЛАБОРАТОРИЮ В 1% ПВ

Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью определения их принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей серогруппы (О1, О139 или других).

К виду V. cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющие маннит, маннозу, сахарозу, но неактивные в отношении к арабинозе, инозиту, салицину и некоторым другим субстратам. Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не обладают дигидролазой аргинина, образуют индол, обладают нитратредуктазой, не продуцируют сероводород. Таксономическое положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.

Рис. 2. Классификация вибрионов <1>

<1> Таксономия вибрионов представлена по Bergeys manual of Determinative Bacteriology, 1994;

<2> Типовые штаммы О2 - О39 соответствуют Sakazaki (1970); О40 - О83, а также О12; О23 и О26 не изучены в сравнении с международной коллекцией типовых штаммов.

Таблица 2

ОСНОВНЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ РОДА VIBRIO И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Таблица 3

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИДОВ РОДА VIBRIO

Таблица 4

ОТНОШЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ К ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИМ УГЛЕВОДАМ

Возбудителями холеры являются V. cholerae О1 (биоваров классического и эльтор; сероваров Инаба, Огава или Гикошима) и О139 серогрупп.

Токсигенные, эпидемически значимые варианты холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, содержащие гены холерного токсина (ctx АВ) и токсин-корегулируемых пилей (tcp А), вызывают заболевания холерой, склонные к эпидемическому распространению.

Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина), эпидемически неопасные варианты холерных вибрионов О1 могут вызывать спорадические или групповые заболевания холерой при общем источнике заражения.

Вид V. cholerae помимо возбудителей холеры включает холерные вибрионы других О серогрупп, в настоящее время их известно более 200. Отдельные штаммы некоторых из них могут вызывать единичные случаи диарей или заболевания с внекишечной локализацией возбудителя. Известны отдельные групповые заболевания или вспышки диарей, обусловленных ими, при общем источнике заражения.

Идентификацию выделенных на полиуглеводной среде или щелочном агаре агглютинирующихся на стекле культур проводят по сокращенной или полной схеме.

Сокращенная схема идентификации типичных по культуральным и морфологическим препаратам оксидазопозитивных культур, агглютинирующихся в слайд-агглютинации холерной О1 или О139 сывороткой, предусматривает изучение культуры в развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками О1, Инаба, Огава и РО, определение чувствительности к диагностическим бактериофагам классическому и эльтор, отношения к глюкозе в среде Хью-Лейфсона, сахарозе, маннозе, манниту и арабинозе в средах Гиса, а также лизину, орнитину и аргинину, и ориентировочную оценку эпидемической значимости по гемолитической активности в пробе Грейга и чувствительности к холерным эльтор ctx+ и ctx- фагам.

Культуры оксидазопозитивных, активно подвижных вибрионов, расщепляющие глюкозу в среде Хью-Лейфсона до кислоты без газа, декорбоксилирующие лизин и орнитин, не обладающие дигидролазой аргинин, ферментирующие сахарозу, маннозу, маннит в средах Гисса и инактивные по отношению к арабинозе, агглютинирующиеся не менее чем до 1/2 титра сыворотками О1 и одной из вариантоспецифических сывороток, относят к V. cholerae О1 серовара Огава или Инаба. Культуры, агглютинирующиеся обеими вариантоспецифическими сыворотками не менее чем до 1/2 титра, относят к серовару Гикошима. В случае агглютинабельности выделенной культуры обеими вариантоспецифическими сыворотками целесообразно повторить исследование с использованием различных серий коммерческих препаратов.

Для подтверждения принадлежности выделенной культуры холерных вибрионов к О139 серогруппе достаточно положительного результата в слайд-агглютинации с соответствующей сывороткой в рабочем разведении.

Полная схема идентификации культур, агглютинирующихся холерными сыворотками О1 серогруппы, предусматривает изучение их по дополнительным тестам, определяющим принадлежность к биовару (гемагглютинация, чувствительность к поликсимину, реакция Фогес-Проскауэра), определение антибиотикограммы, окончательную оценку эпидзначимости по результатам исследования в ПЦР на наличие генов ctx и tcp и определение токсигенности на модели кроликов-сосунков.

В случае выделения культур холерных вибрионов О139 серогруппы, их также изучают по чувствительности к антибиотикам, определяют эпидемическую значимость ориентировочно по гемолитической активности в пробе Грейга, окончательно - указанными выше специальными методами.

Токсигенные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, как правило, не лизируют эритроциты барана в пробе Грейга в отличие от нетоксигенных штаммов.

На культуры, имеющие характерные для вибрионов морфологические, культуральные и биохимические признаки, агглютинирующиеся О1 и одной из вариантоспецифических сывороток не менее чем до 1/2 титра, лизирующиеся и не лизирующиеся холерным и эльтор фагами, а также на культуры, агглютинирующиеся сывороткой О139, выдают окончательный ответ, указывая чувствительность их к антибиотикам и оценку эпидемической значимости по результатам ориентировочных или специальных исследований.

Кроме того, для холерных вибрионов О1 серогруппы указывают биовар на основании чувствительности к одному из диагностических фагов (эльтор или классическому) и (или) по дополнительным признакам - для фагорезистентных культур (табл. 5).

Таблица 5

ПРИЗНАКИ, ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ БИОВАРЫ V. CHOLERAE О1

Культуры, имеющие признаки вибрионов по морфологии колоний и клеток, тесту на индофенолоксидазу и ферментативной активности на полиуглеводной среде, не агглютинирующиеся на стекле холерными сыворотками О1 и О139 серогрупп, выделенные от больных острыми кишечными инфекциями, идентифицируют по тестам, определяющим принадлежность к роду Vibrio и виду V. cholerae (табл. 2 и 3). Принадлежащие к V. cholerae культуры изучают в пробе с диагностическими фагами. При выделении чувствительных к холерным диагностическим монофагам, но не агглютинирующихся холерными сыворотками О1 культур, особое значение имеет изучение их клеточного состава, т.к. в популяции таких штаммов могут находиться типичные холерные вибрионы О1 серогруппы. Если культура по совокупности признаков относится к виду холерных вибрионов, но не агглютинируется холерными О1 и О139 сыворотками, ее изучают в реакции агглютинации с набором диагностических холерных сывороток О2 - О83 серогрупп по отечественной классификации (рис. 2).

На культуры, агглютинирующиеся одной из сывороток, выдают ответ о выделении V. cholerae О2, О5 или другой серогруппы.

Если культуры не типируются указанными холерными сыворотками или они отсутствуют в лаборатории, то выделенную культуру обозначают обобщенно - V. cholerae non О1/О139 серогрупп.

Кроме этого, штаммы V. cholerae non О1 типируют бактериофагами диагностическими холерными ТЭПВ 1 - 7.

Энтеропатогенные холерные вибрионы не О1 группы относятся преимущественно к О2, О5, О6, О8, О11, О13, О18, О37, О47, О50, О62, О65, О82, О83 серогруппам и, как правило, лизируются фагами ТЭПВ 1, 4, 7.

У выделенных от больных штаммов холерных вибрионов не О1/О139 серогрупп определяют антибиотикограмму. Для выделенных из окружающей среды вибрионов, не аггтлютинирущихся холерными О1 и О139 сыворотками, целесообразность полной таксономической характеристики определяется в каждом случае отдельно для конкретных территорий и объектов с учетом эпидситуации по холере и регистрации острых кишечных заболеваний, обусловленных этими микроорганизмами.

Идентификация атипичных культур холерных вибрионов

К атипичным относят культуры холерных вибрионов, отклоняющиеся от типичных по отдельным родовым и видовым признакам, а также по агглютинабельности группо- и вариантоспецифическими сыворотками О1 и чувствительности к диагностическим фагам (классическому и эльтор). Антигенная изменчивость холерных вибрионов О1 может выражаться в ослаблении до 1/4 титра или утрате агглютинабельности холерными сыворотками О1, Инаба, Огава. Встречаются штаммы, агглютинирующиеся только холерной сывороткой О1 серогруппы и не реагирующие с вариантоспецифическими сыворотками (Инаба и Огава), что делает невозможным установление их серовара. В случае S-R диссоциации культуры холерных вибрионов начинают агглютинироваться РО-сывороткой. При этом в одних случаях штаммы агглютинируются всеми холерными сыворотками, в т.ч. и РО, их обозначают как SR-варианты, в других - измененные холерные вибрионы в диагностических титрах агглютинируются только с РО-сывороткой и не агглютинируются холерными сыворотками О1, Инаба и Огава, их относят к R-вариантам.

В последние годы возросла частота встречаемости резистентных к диагностическим холерным фагам штаммов среди холерных вибрионов О1, выделяемых как от людей, так и из объектов окружающей среды.

При этом фагоустойчивость вибрионов, снижение или отсутствие агглютинабельности холерными сыворотками иногда сочетается с вариабельностью по другим признакам (культурально-морфологическим и биохимическим). Штаммы, атипичные то морфологическим признакам, образуют шероховатые, слизистые, мутные и пигментированные колонии. Размер их также может варьировать, вплоть до появления едва видимых карликовых колоний. У таких культур нередко снижена подвижность, наблюдается спонтанная агглютинация в 0,9%-м растворе натрия хлорида. Отмечена возможность обнаружения в организме больного и в воде открытых водоемов холерных вибрионов в Л-форме. В мазках, сделанных из атипичных культур холерных вибрионов, клетки имеют форму шаров, сферопластов, встречаются вытянутые, извитые, неделящиеся клетки в виде цепей или нитей.

Нередко встречаются штаммы, измененные по биохимическим свойствам, у которых отмечается ослабление, замедление или утрата способности расщеплять углеводы и многоатомные спирты (крахмал, маннит, маннозу, сахарозу), аминокислоты (триптофан, лизин, орнитин) и другие субстраты.

Во всех случаях выделения атипичных культур обязательно изучение их по признакам, определяющим их принадлежность к роду Vibrio и виду Vibrio cholerae (определение типа расщепления глюкозы в среде Хью-Лейфсона, декарбоксилаз лизина и орнитина и дигидролазы аргинина, чувствительности в вибриостатику О129 - 2,4-диамино-6,7-диизопропилптеридину и др.).

Атипичные культуры холерных вибрионов, обладающие указанными выше признаками рода Vibrio и вида Vibrio cholerae, агглютинирующиеся сывороткой О1 до 1/4 титра, лизирующиеся и не лизирующиеся диагностическими монофагами до ДРТ, следует относить к серогруппе О1.

Для всестороннего изучения все атипичные культуры холерных вибрионов следует направлять в специализированные лаборатории.

Для подтверждения принадлежности к V. cholerae О1 слабоагглютинирующихся (ниже 1/4 титра), диссоциирующих и фагорезистентных культур обязательным является использование высокочувствительных методов (мультиплексным ПЦР набором праймеров) и, по возможности, реакции агглютинации с кроличьими холерными сыворотками, обладающими большей специфичностью, чем лошадиные, поскольку они не содержат пула неспецифических иммуноглобулинов.

Рекомендуется при изучении измененных по антигенной структуре культур использовать также такие методы, как РНГА, РНАт, иммунофлюоресценцию, преципитацию в геле, адсорбцию агглютининов по Кастеллани, реакцию агглютинации с убитыми кипячением культурами, пробу с комплементом, позволяющую отбирать из популяции измененных штаммов типичные, резистентные к нему клоны в S-форме.

При получении сомнительных результатов слайд-агглютинации с холерной сывороткой О139 серогруппы следует повторить исследование с гретой культурой.

Для серологической идентификации спонтанно агглютинирующихся культур применяют те же методы и дополнительно реакцию агглютинации с использованием осажденной культуры и 0,3%-го раствора натрия хлорида для разведения диагностических сывороток и приготовления взвеси изучаемой культуры.

Ответ о положительном результате может быть предварительным и окончательным.

Предварительный положительный ответ выдают по результатам ускоренного исследования нативного материала и после подращивания его в пептонной воде с помощью иммунофлюоресцентного метода, специфической иммобилизации, РНГА, а также по слайд-агглютинации сыворотками О1 и О139 подозрительных на холерный вибрион колоний. При наличии возможности на этом этапе может быть использована ПЦР со специфическими праймерами.

Предварительный ответ в случаях проведения срочных анализов сообщают устно и только при совпадении результатов не менее двух методов.

В условиях эпидемии холеры при проведении массовых исследований после идентификации первых культур такой ответ дает право на проведение противоэпидемических мероприятий.

Окончательный положительный ответ выдают по результатам сокращенной или полной идентификации выделенной культуры в течение 36 - 48 ч.

При проведении массовых исследований в очаге заболеваний холерой, когда первые культуры холерных вибрионов уже были идентифицированы по полной схеме, положительные результаты тестирования в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О1 или О139 серогрупп в сочетании с морфологией и подвижностью клеток культур, выделенных от больных диареями или при обследовании на вибриононосительство, следует считать окончательными для решения вопросов о проведении противоэпидемических мероприятий. Достоверность таких результатов повышается при использовании ускоренных методов диагностики: иммунофлюоресцентного, иммобилизации соответствующими сыворотками, ПЦР и др.

Для полной идентификации выделенные культуры передают в назначенную для этих целей группу или лабораторию, специалисты которой при необходимости вносят в ответ соответствующие коррективы и дополнения, касающиеся определения антибиотикограммы, эпидемической значимости и токсигенности.

Отрицательный ответ может быть дан только по окончании исследования по полной схеме через 36 - 48 ч; при осуществлении эпиднадзора в условиях односменной работы лаборатории, допускающей использование теллурита калия, продолжительность анализа увеличивается до 3 - 4 суток.

Не допускается выдавать отрицательные ответы по результатам ускоренного исследования (МФА, РИВ, РНГА и др.) до окончания анализа как в условиях эпидемии холеры, так и при проведении эпидемиологического надзора.

Схему выдачи ответов см. на рис. 3.

Рис. 3. Схема выдачи результатов исследований на холеру

При осуществлении эпидемиологического надзора направление к анализу, а соответственно и ответ на него, оформляют индивидуально на каждого больного. При проведении большого объема исследований в очаге холеры направления к анализам и ответы на них оформляют списком. При обследовании здоровых людей на вибриононосительство и исследовании на холеру объектов окружающей среды групповые формы направления и ответов допускаются как при эпиднадзоре, так и в очаге холеры.

Учет анализов и культур ведут по установленным формам (Прилож. 6, 7). Обязательным является ведение рабочих записей идентификации исследования подозрительных культур (Прилож. 8), регистрация выделенных культур (Прилож. 9), составление паспорта штамма (Прилож. 10).

При работе в очаге холеры используют упрощенные формы регистрации анализов, учитывая, что более подробные сведения имеются в бланках направлений, находящихся в лаборатории до ликвидации очага. Для удобства работы направления за каждый день подшивают отдельно.