Последнее обновление: 28.03.2024
Законодательная база Российской Федерации
8 (800) 350-23-61
Бесплатная горячая линия юридической помощи
- Главная
- "ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)
7.1. Питательные среды
Транспортные среды:
1%-я пептонная вода, рН 8,5 +/- 0,1 без ингибиторов роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см. среды обогащения);
2%-й раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1 г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость пропускают через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 0,7 атм.
Среды обогащения
а) Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:
Пептон сухой - 100,0
Натрия хлорид - 50,0
Калия нитрат - 10,0
Натрия карбонат - 25,0
Дистиллированная вода - 1 л
рН 8,4 +/- 0,1.
В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, рН доводят до 8,5 +/- 0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 1 атм.
Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.
б) 1%-я пептонная вода.
Для получения 1%-й пептонной воды концентрированный раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления рН 8,5 +/- 0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 мин. при давлении 0,7 атм.
Можно готовить 1%-ю пептонную воду и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и основного пептона.
в) Пептонная вода с теллуритом калия.
В 1%-ю пептонную воду (рН 8,5 +/- 0,1) после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1%-й раствор теллурита калия (1:1000). Срок хранения рабочих растворов 7 дней.
Плотные среды для выделения холерных вибрионов
Щелочной мясопептонный агар:
Мясная вода - 1 л
Пептон - 10,0
Натрия хлорид - 5,0
Агар-агар - 20,0
рН 8,0 +/- 0,2.
В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20%-м раствором едкого натра до рН 8,3 +/- 0,1. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды в начале текучим паром в течение 30 - 40 мин., а затем при 1 атм. 20 мин. Если мясопептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.
Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью отстоя на 2 - 3 ч оставляют в автоклаве или помещают в термостатную комнату при температуре (43 +/- 2) °С, лучше время отстоя продлить до 18 - 20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 1,0 атм. 20 мин.
Элективные среды
Рекомендуется использовать питательную среду для выделения холерных вибрионов элективно-дифференциальную сухую (СЭДХ).
Среда обладает выраженными элективными свойствами, обеспечивая ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и др.) и практически не влияет на рост вибрионов. Холерные вибрионы О1 и не О1 групп через 12 - 18 ч формируют на этих средах плоские прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы диаметром 1,0 - 2,0 мм; V. parahaemolyticus - мелкие, голубоватые (цвета среды) с уплотненным центром; V. alqinolyticus - крупные, желтые; колонии Pseudomonas, Aeromonas - голубые, Enterobacteriaceae - очень мелкие, плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый цвет; колонии протея, как правило, не роятся.
Среды для идентификации вибрионов
а) Среды с углеводами для отбора колоний:
Среда Ресселя
Пептон - 5,0
Натрия хлорид - 5,0
Лактоза - 10,0
Глюкоза - 1,0
Агар-агар - 10,0
Индикатор Андреде - 40 мл
Вода дистиллированная - 1 л
рН 7,3 +/- 0,1.
Среду варят, фильтруют, разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк. Среда светлая.
Среду можно готовить на 1,0 - 1,3%-м питательном агаре, добавляя к нему в соответствующих концентрациях углеводы и индикатор Андреде.
Готовится как и среда Ресселя, но вместо глюкозы берут сахарозу в том же количестве.
Среда Клиглера
1,5 - 1,7%-й мясопептонный агар или другой
слабощелочной питательный агар - 1 л
Лактоза - 10,0
Глюкоза - 1,0
2%-й раствор серно-кислого закисного железа - 10,0 мл
0,8%-й раствор тиосульфата натрия - 10,0 мл
0,4%-й раствор сульфата натрия - 10,0 мл
1%-й раствор фенолового красного - 24,0 мл
рН 7,3 +/- 0,1.
Вначале в расплавленном питательном агаре (рН 7,7 +/- 0,1) растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин. при давлении 0,5 атм. и скашивают по типу среды Ресселя; рН готовой среды 7,3 +/- 0,1; цвет красный.
Маннозо-сахарозная среда
Манноза - 1,0
Сахароза - 10,0
Серно-кислое железо (FeSO4) - 0,2
Гипосульфит натрия (Na2SO3 х 5Н2О) - 0,08
Сульфит натрия (Na2SO3) - 0,4
0,2%-й феноловый красный - 10,0.
После расплавления рН среды довести до 8,0, разлить в пробирки по 5 - 7 мл и стерилизовать при 0,7 атм. 15 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.
6) Среды для идентификации.
Среды Гисса
К 100 мл 1%-й пептонной воды (рН 7,3 +/- 0,1) без селитры добавляют 0,5 - 1,0% необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза, D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза, растворимый крахмал и др.) и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.; среду с L-арабинозой следует стерилизовать в течение 20 мин. при 0,1 - 0,2 атм. Для приготовления сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов. Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции - желтого цвета, при щелочной - синего.
Среда Хью-Лейфсона
Пептон - 2,0
Натрия хлорид - 5,0
Двузамещенный фосфат калия - 0,3
Глюкоза - 10,0
Агар-агар - 3,0
Дистиллированная вода - 1 л
рН 7,1 +/- 0,1.
К воде добавляют пептон, натрия хлорид и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2 - 3 мин. Смесь подщелачивают 20%-м раствором едкого натрия до рН 7,4 +/- 0,1, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1%-го водного раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4 - 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Цвет среды до стерилизации синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый, рН 7,1 +/- 0,1. При кислой реакции среда желтеет.
Бульон Кларка
Пептон - 5,0
Глюкоза - 5,0
Двузамещенный фосфат калия - 5,0
Дистиллированная вода - 1 л.
Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин.
Среда Кодама. В 1%-ю пептонную воду добавляют 0,5% растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин. под давлением 0,5 атм. Для оценки результатов расщепления крахмала используют реактив Люголя.
Среда с желатиной. К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10,0 - 15,0 г на 100 мл (летом концентрацию желатины увеличивают до 20%). Желатине дают набухать в течение 30 мин. и затем растворяют при медленном нагревании в водяной бане при температуре (45,0 +/- 5,0) °С. Устанавливают рН 7,1 +/- 0,1, прибавляя к расплавленной желатине 10%-й раствор двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают текучим паром в течение 20 мин. до полного свертывания белка и просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду, разлитую по 5 - 8 мл в пробирки, стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застывании оставалась совершенно ровной.
Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот
Пептон - 5,0
Дрожжевой экстракт - 25,0 (сухой 3,0)
Глюкоза - 1,0
Натрия хлорид - 5,0
Натрия карбонат - 0,1
Бромтимоловый синий
(0,1%-й раствор в 20%-м спирте) - 45,0 (0,045 г сухого)
Дистиллированная вода - 1 л
рН 6,4 +/- 0,1.
Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при нагревании, устанавливают рН 6,4 +/- 0,1, затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую - 1% лизина, во вторую - 1% орнитина, в третью - 1% аргинина. Аминокислоты должны быть в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2%, т.к. микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления аминокислот перед стерилизацией в случае необходимости реакцию среды исправляют 0,1%-м раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1 - 2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,1 - 0,2 атм. 20 мин. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной - синеет.
Мясопептонный бульон: мясная вода с 1% сухого пептона и 0,85% поваренной соли. Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли, устанавливают нужную реакцию среды, стерилизуют при 0,7 атм. 20 мин.
- Главная
- "ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)