Законодательная база Российской Федерации

"ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

Вибриоцидные антитела в крови больных обнаруживаются и достигают максимальных значений 10(-4) - 10(-8) к 10 - 12 дню. Принцип метода во всех его вариантах заключается в том, что в присутствии вибриоцидных антител не происходит размножение холерных вибрионов.

При проведении серологических исследований в очаге, обусловленном возбудителем холеры определенного серовара, в реакции используют один штамм соответствующего серовара, при отсутствии этих данных - два штамма обоих сероваров.

Материалы и оборудование:

- исследуемые сыворотки, инактивированные прогреванием 30 мин. при температуре (56,0 +/- 0,5) °С;

- сухой комплемент или свежеполученная сыворотка морской свинки в разведении 1:20;

- 0,9%-й раствор хлорида натрия рН 7,2 +/- 0,1;

- штаммы холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, типичные в S-форме, не чувствительные к комплементу;

- чашки Петри со щелочным агаром;

- лоток со льдом;

- термостат на (37,0 +/- 1,0) °С.

Методика постановки реакции

Комплемент, разведенный 0,9%-м раствором хлорида натрия 1:20, разливают в два ряда пробирок по 0,9 мл. В первую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания последовательно переносят по 0,1 мл до разведения 10(-10), получая десятикратные разведения сыворотки в объеме 0,9 мл. Титрацию сыворотки проводят на льду, который помещают в любую емкость.

Из односуточной агаровой культуры холерного вибриона готовят взвесь в 0,9%-м растворе хлорида натрия, содержащего в 1 мл 1 - 2 х 10(4) м.к. Стерильной градуированной пипеткой полученную взвесь по 0,1 мл вносят в опытные пробирки с раститрованной сывороткой.

Необходимы следующие контроли: а) контроль комплемента (0,9 мл комплемента и 0,1 мл культуры); б) контроль сыворотки (0,8 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,1 мл культуры); в) контроль культуры (0,9 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия и 0,1 мл культуры).

Штатив с пробирками на 1 ч помещают в водяную баню или термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С, сделав предварительно высев из пробирки контроля культуры на 2 пластинки щелочного агара для определения фактической концентрации живых вибрионов в опытной суспензии (контроль разведения).

Через 1 ч штатив вновь ставят на лед и из каждой пробирки отдельной стерильной пипеткой 0,1 мл культуры высевают на чашку с щелочным агаром рН 7,0 +/- 0,1. Посев равномерно распределяют по поверхности чашки покачиванием или шпателем. Чашки помещают на 18 - 24 ч в термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

В посевах из контрольных пробирок с культурой должно вырастать количество колоний, близкое к контролю разведения.

Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки, которое вызывает гибель не менее чем 50% клеток холерного вибриона, что выявляется при посеве на агаровые пластинки в чашки Петри по сравнению с количеством выросших колоний из пробирки контроля комплемента.

Пример вычисления: при посеве из опытных пробирок с разведением сыворотки 10(-1); 10(-2); 10(-3); 10(-4); 10(-5); 10(-6); 10(-7) и т.д. на чашках соответственно выросло 0; 0; 5; 10; 15; 30; 38 и т.д. колоний. При высеве из пробирки контроля комплемента также после часовой инкубации при температуре (37,0 +/- 0,5) °С выросло 36 колоний, 50% от этого числа будет составлять 18. Из 5-й пробирки выросло 15 колоний, т.е. меньше 50% от количества колоний в контроле (18), в следующей - 30, т.е. более 50% этого же показателя. Разведение сыворотки в 5-й пробирке составляет 10(-5), следовательно, вибриоцидный титр в данном примере будет составлять 10(-5).

Определение вибриоцидных антител (ВА) в сыворотке крови на основе ферментации углеводов

Об отсутствии или наличии ВА судят по ферментации сахарозы, регистрируемой с помощью индикатора.

Материалы и оборудование:

- инактивированная сыворотка крови;

- штаммы холерного вибриона серовара Огава и Инаба;

- комплемент, разведенный 1:20 1%-й пептонной водой, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде;

- термостат на (37,0 +/- 1) °С.

Методика постановки реакции

Комплемент, разведенный 1:20 1%-й пептонной водой с сахарозой и индикатором Андреде разливают в пробирки по 0,45 мл. В первую пробирку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания переносят 0,05 мл смеси во вторую пробирку, из второй в третью и т.д. (до разведения 10(-5) - 10(-9)). Готовят суспензию 18 - 20-часовой агаровой культуры холерного вибриона и разводят 1%-й пептонной водой до концентрации 10(3) м.к./мл. Во все пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают в термостат.

Постановку реакции сопровождают следующими контролями:

- 0,45 мл 1%-й пептонной воды, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыворотки + 0,45 мл взвеси культуры - контроль сыворотки;

- 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль комплемента;

- 0,45 мл 1%-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль культуры;

- 0,45 мл 1%-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,05 мл исследуемой сыворотки - контроль стерильности сыворотки.

Через 5 - 6 ч проводят учет реакции. При этом в контроле (кроме контроля стерильности сыворотки) цвет содержимого пробирок должен перейти в красный или розовый. Изменение цвета индикатора в пробирках рабочего ряда, связанное с ферментацией сахарозы размножившимися вибрионами, свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке. За вибриоцидный титр принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается неизмененным или интенсивность его значительно отличается от окраски контрольных проб. Результат выражают в виде десятичного логарифма разведения сыворотки, взятого с обратным знаком.

Примечание. Для постановки РВА при холере, обусловленной холерным вибрионом О139 серогруппы, не может быть использован выделенный в очаге штамм в связи с возможной чувствительностью его к комплементу. В этих случаях рекомендуется предложенный специалистами Ростовского НИПЧИ, ctx- клон холерного вибриона О139, направленный на депонирование в Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб" (РосНИПЧИ "Микроб").