Законодательная база Российской Федерации

"ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью определения их принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей серогруппы (О1, О139 или других).

К виду V. cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющие маннит, маннозу, сахарозу, но неактивные в отношении к арабинозе, инозиту, салицину и некоторым другим субстратам. Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не обладают дигидролазой аргинина, образуют индол, обладают нитратредуктазой, не продуцируют сероводород. Таксономическое положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.

Рис. 2. Классификация вибрионов <1>

<1> Таксономия вибрионов представлена по Bergeys manual of Determinative Bacteriology, 1994;

<2> Типовые штаммы О2 - О39 соответствуют Sakazaki (1970); О40 - О83, а также О12; О23 и О26 не изучены в сравнении с международной коллекцией типовых штаммов.

Таблица 2

ОСНОВНЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ РОДА VIBRIO И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Таблица 3

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИДОВ РОДА VIBRIO

Таблица 4

ОТНОШЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ВИБРИОНОВ К ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИМ УГЛЕВОДАМ

Возбудителями холеры являются V. cholerae О1 (биоваров классического и эльтор; сероваров Инаба, Огава или Гикошима) и О139 серогрупп.

Токсигенные, эпидемически значимые варианты холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, содержащие гены холерного токсина (ctx АВ) и токсин-корегулируемых пилей (tcp А), вызывают заболевания холерой, склонные к эпидемическому распространению.

Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина), эпидемически неопасные варианты холерных вибрионов О1 могут вызывать спорадические или групповые заболевания холерой при общем источнике заражения.

Вид V. cholerae помимо возбудителей холеры включает холерные вибрионы других О серогрупп, в настоящее время их известно более 200. Отдельные штаммы некоторых из них могут вызывать единичные случаи диарей или заболевания с внекишечной локализацией возбудителя. Известны отдельные групповые заболевания или вспышки диарей, обусловленных ими, при общем источнике заражения.

Идентификацию выделенных на полиуглеводной среде или щелочном агаре агглютинирующихся на стекле культур проводят по сокращенной или полной схеме.

Сокращенная схема идентификации типичных по культуральным и морфологическим препаратам оксидазопозитивных культур, агглютинирующихся в слайд-агглютинации холерной О1 или О139 сывороткой, предусматривает изучение культуры в развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками О1, Инаба, Огава и РО, определение чувствительности к диагностическим бактериофагам классическому и эльтор, отношения к глюкозе в среде Хью-Лейфсона, сахарозе, маннозе, манниту и арабинозе в средах Гиса, а также лизину, орнитину и аргинину, и ориентировочную оценку эпидемической значимости по гемолитической активности в пробе Грейга и чувствительности к холерным эльтор ctx+ и ctx- фагам.

Культуры оксидазопозитивных, активно подвижных вибрионов, расщепляющие глюкозу в среде Хью-Лейфсона до кислоты без газа, декорбоксилирующие лизин и орнитин, не обладающие дигидролазой аргинин, ферментирующие сахарозу, маннозу, маннит в средах Гисса и инактивные по отношению к арабинозе, агглютинирующиеся не менее чем до 1/2 титра сыворотками О1 и одной из вариантоспецифических сывороток, относят к V. cholerae О1 серовара Огава или Инаба. Культуры, агглютинирующиеся обеими вариантоспецифическими сыворотками не менее чем до 1/2 титра, относят к серовару Гикошима. В случае агглютинабельности выделенной культуры обеими вариантоспецифическими сыворотками целесообразно повторить исследование с использованием различных серий коммерческих препаратов.

Для подтверждения принадлежности выделенной культуры холерных вибрионов к О139 серогруппе достаточно положительного результата в слайд-агглютинации с соответствующей сывороткой в рабочем разведении.

Полная схема идентификации культур, агглютинирующихся холерными сыворотками О1 серогруппы, предусматривает изучение их по дополнительным тестам, определяющим принадлежность к биовару (гемагглютинация, чувствительность к поликсимину, реакция Фогес-Проскауэра), определение антибиотикограммы, окончательную оценку эпидзначимости по результатам исследования в ПЦР на наличие генов ctx и tcp и определение токсигенности на модели кроликов-сосунков.

В случае выделения культур холерных вибрионов О139 серогруппы, их также изучают по чувствительности к антибиотикам, определяют эпидемическую значимость ориентировочно по гемолитической активности в пробе Грейга, окончательно - указанными выше специальными методами.

Токсигенные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, как правило, не лизируют эритроциты барана в пробе Грейга в отличие от нетоксигенных штаммов.

На культуры, имеющие характерные для вибрионов морфологические, культуральные и биохимические признаки, агглютинирующиеся О1 и одной из вариантоспецифических сывороток не менее чем до 1/2 титра, лизирующиеся и не лизирующиеся холерным и эльтор фагами, а также на культуры, агглютинирующиеся сывороткой О139, выдают окончательный ответ, указывая чувствительность их к антибиотикам и оценку эпидемической значимости по результатам ориентировочных или специальных исследований.

Кроме того, для холерных вибрионов О1 серогруппы указывают биовар на основании чувствительности к одному из диагностических фагов (эльтор или классическому) и (или) по дополнительным признакам - для фагорезистентных культур (табл. 5).

Таблица 5

ПРИЗНАКИ, ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ БИОВАРЫ V. CHOLERAE О1

Культуры, имеющие признаки вибрионов по морфологии колоний и клеток, тесту на индофенолоксидазу и ферментативной активности на полиуглеводной среде, не агглютинирующиеся на стекле холерными сыворотками О1 и О139 серогрупп, выделенные от больных острыми кишечными инфекциями, идентифицируют по тестам, определяющим принадлежность к роду Vibrio и виду V. cholerae (табл. 2 и 3). Принадлежащие к V. cholerae культуры изучают в пробе с диагностическими фагами. При выделении чувствительных к холерным диагностическим монофагам, но не агглютинирующихся холерными сыворотками О1 культур, особое значение имеет изучение их клеточного состава, т.к. в популяции таких штаммов могут находиться типичные холерные вибрионы О1 серогруппы. Если культура по совокупности признаков относится к виду холерных вибрионов, но не агглютинируется холерными О1 и О139 сыворотками, ее изучают в реакции агглютинации с набором диагностических холерных сывороток О2 - О83 серогрупп по отечественной классификации (рис. 2).

На культуры, агглютинирующиеся одной из сывороток, выдают ответ о выделении V. cholerae О2, О5 или другой серогруппы.

Если культуры не типируются указанными холерными сыворотками или они отсутствуют в лаборатории, то выделенную культуру обозначают обобщенно - V. cholerae non О1/О139 серогрупп.

Кроме этого, штаммы V. cholerae non О1 типируют бактериофагами диагностическими холерными ТЭПВ 1 - 7.

Энтеропатогенные холерные вибрионы не О1 группы относятся преимущественно к О2, О5, О6, О8, О11, О13, О18, О37, О47, О50, О62, О65, О82, О83 серогруппам и, как правило, лизируются фагами ТЭПВ 1, 4, 7.

У выделенных от больных штаммов холерных вибрионов не О1/О139 серогрупп определяют антибиотикограмму. Для выделенных из окружающей среды вибрионов, не аггтлютинирущихся холерными О1 и О139 сыворотками, целесообразность полной таксономической характеристики определяется в каждом случае отдельно для конкретных территорий и объектов с учетом эпидситуации по холере и регистрации острых кишечных заболеваний, обусловленных этими микроорганизмами.

Идентификация атипичных культур холерных вибрионов

К атипичным относят культуры холерных вибрионов, отклоняющиеся от типичных по отдельным родовым и видовым признакам, а также по агглютинабельности группо- и вариантоспецифическими сыворотками О1 и чувствительности к диагностическим фагам (классическому и эльтор). Антигенная изменчивость холерных вибрионов О1 может выражаться в ослаблении до 1/4 титра или утрате агглютинабельности холерными сыворотками О1, Инаба, Огава. Встречаются штаммы, агглютинирующиеся только холерной сывороткой О1 серогруппы и не реагирующие с вариантоспецифическими сыворотками (Инаба и Огава), что делает невозможным установление их серовара. В случае S-R диссоциации культуры холерных вибрионов начинают агглютинироваться РО-сывороткой. При этом в одних случаях штаммы агглютинируются всеми холерными сыворотками, в т.ч. и РО, их обозначают как SR-варианты, в других - измененные холерные вибрионы в диагностических титрах агглютинируются только с РО-сывороткой и не агглютинируются холерными сыворотками О1, Инаба и Огава, их относят к R-вариантам.

В последние годы возросла частота встречаемости резистентных к диагностическим холерным фагам штаммов среди холерных вибрионов О1, выделяемых как от людей, так и из объектов окружающей среды.

При этом фагоустойчивость вибрионов, снижение или отсутствие агглютинабельности холерными сыворотками иногда сочетается с вариабельностью по другим признакам (культурально-морфологическим и биохимическим). Штаммы, атипичные то морфологическим признакам, образуют шероховатые, слизистые, мутные и пигментированные колонии. Размер их также может варьировать, вплоть до появления едва видимых карликовых колоний. У таких культур нередко снижена подвижность, наблюдается спонтанная агглютинация в 0,9%-м растворе натрия хлорида. Отмечена возможность обнаружения в организме больного и в воде открытых водоемов холерных вибрионов в Л-форме. В мазках, сделанных из атипичных культур холерных вибрионов, клетки имеют форму шаров, сферопластов, встречаются вытянутые, извитые, неделящиеся клетки в виде цепей или нитей.

Нередко встречаются штаммы, измененные по биохимическим свойствам, у которых отмечается ослабление, замедление или утрата способности расщеплять углеводы и многоатомные спирты (крахмал, маннит, маннозу, сахарозу), аминокислоты (триптофан, лизин, орнитин) и другие субстраты.

Во всех случаях выделения атипичных культур обязательно изучение их по признакам, определяющим их принадлежность к роду Vibrio и виду Vibrio cholerae (определение типа расщепления глюкозы в среде Хью-Лейфсона, декарбоксилаз лизина и орнитина и дигидролазы аргинина, чувствительности в вибриостатику О129 - 2,4-диамино-6,7-диизопропилптеридину и др.).

Атипичные культуры холерных вибрионов, обладающие указанными выше признаками рода Vibrio и вида Vibrio cholerae, агглютинирующиеся сывороткой О1 до 1/4 титра, лизирующиеся и не лизирующиеся диагностическими монофагами до ДРТ, следует относить к серогруппе О1.

Для всестороннего изучения все атипичные культуры холерных вибрионов следует направлять в специализированные лаборатории.

Для подтверждения принадлежности к V. cholerae О1 слабоагглютинирующихся (ниже 1/4 титра), диссоциирующих и фагорезистентных культур обязательным является использование высокочувствительных методов (мультиплексным ПЦР набором праймеров) и, по возможности, реакции агглютинации с кроличьими холерными сыворотками, обладающими большей специфичностью, чем лошадиные, поскольку они не содержат пула неспецифических иммуноглобулинов.

Рекомендуется при изучении измененных по антигенной структуре культур использовать также такие методы, как РНГА, РНАт, иммунофлюоресценцию, преципитацию в геле, адсорбцию агглютининов по Кастеллани, реакцию агглютинации с убитыми кипячением культурами, пробу с комплементом, позволяющую отбирать из популяции измененных штаммов типичные, резистентные к нему клоны в S-форме.

При получении сомнительных результатов слайд-агглютинации с холерной сывороткой О139 серогруппы следует повторить исследование с гретой культурой.

Для серологической идентификации спонтанно агглютинирующихся культур применяют те же методы и дополнительно реакцию агглютинации с использованием осажденной культуры и 0,3%-го раствора натрия хлорида для разведения диагностических сывороток и приготовления взвеси изучаемой культуры.