Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздравмедпрома РФ N 101, Госкомсанэпиднадзора РФ N 46 от 19.04.95 "О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ ОТ ГРИППА И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

Современные методы лабораторного обследования больных с острыми респираторными вирусными инфекциями включают изоляцию вирусов, индикацию вирусных антигенов в материалах от больных (быстрая диагностика) и выявление специфических антител в сыворотках больных в острой фазе инфекции и стадии реконвалесценции.

Частота выделения респираторных вирусов зависит от сроков взятия материалов от больных, условий их хранения, доставки и времени первичной обработки. Решающее значение имеет ассортимент и качество клеточных культур и куриных эмбрионов, на которых проводят изоляцию вирусов.

Рекомендуемый состав культур для изоляции вирусов гриппа и ОРЗ:

1) первичная культура клеток почек эмбриона человека (ПЭЧ);

2) перевиваемые культуры клеток МДСК, Неla (или HEp2);

3) фибробласты легкого эмбриона человека (ЛЭЧ).

Материалом для выделения вирусов служат отделяемое носа, зева, конъюнктивы, а также секционный материал (ткани легкого, кусочки бронхов и др.).

Материал отбирают с помощью стерильного тампона, который погружают затем в пробирки с 5,0 мл среды Игла или среды 199 с антибиотиками и немедленно направляют в лабораторию, где тампоны с вирусным материалом отжимают в среду, материал центрифугируют в течение 20 мин при 2000-3000 об/мин и температуре 4°С или используют в неосветленном виде.

Кусочки секционного материала растирают в фарфоровой ступке со стеклянным песком, добавляют 10-кратное количество раствора Хенкса, взвесь ресуспендируют, после чего осветляют центрифугированием. Надосадочную жидкость используют для заражения куриных эмбрионов или тканевых культур.

1.1. Изоляция и идентификация вирусов

Для выделения вирусов гриппа исследуемые материалы после их первичной обработки вводят по 0,1 мл в амниотическую полость и по 0,2 мл в аллантоисную полость 10-дневных куриных эмбрионов.

Заражение проводят в затемненном боксе через боковую поверхность скорлупы, направляя иглу сначала в амниотическую, а затем в аллантоисную полости, предварительно сделав дополнительный прокол в скорлупе над воздушной камерой. Материалом от одного больного заражают 3 эмбриона.

Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате 72 часа при 33-34°С. После инкубации эмбрионы помещают на ночь в рефрижератор при 4°С.

Индикацию вируса гриппа осуществляют в реакции гемагглютинации (РГА) путем добавления 0,5 мл 1% суспензии отмытых эритроцитов кур к 0,5 мл вируссодержащего материала. Результаты РГА учитывают после 30-минутного оседания эритроцитов в лунках панелей при комнатной температуре.

При отсутствии агглютинации эритроцитов необходимо провести 3 дополнительных пассажа путем заражения эмбрионов смесью амниотической и аллантоисной жидкостей от предыдущего пассажа. В случае отрицательных результатов РГА после 3-х пассажей исследование материалов прекращают.

Идентификацию вирусов гриппа проводят в РТГА.

Для этого к 0,2 мл последовательных разведений типоспецифических иммунных сывороток добавляют по 0,2 мл рабочей дозы вируса в количестве 4 гемагглютинирующих единиц (ГЕ). Одной ГЕ считают последнее разведение вируса, дающее отчетливую гемагглютинацию. После 1-часового контакта сыворотки с вирусом при комнатной температуре в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1% взвести куриных эритроцитов. Титром сывороток считают ее последнее разведение, блокирующее 4 ГЕ вируса.

Типовую принадлежность вируса определяют по ингибиции гемагглютинации, которая должна быть зарегистрирована в разведении не менее, чем 1:20.

Выделение вирусов гриппа может быть осуществлено на чувствительных культурах клеток, чаще всего МДСК. Для этого в пробирки монослоем, отмытым физиологическим фосфатным буфером или раствором Хэнкса, вносят по 0,2 мл материала от больного. Через 1 ч адсорбции при 38 °С в культуры добавляют по 1,5 мл поддерживающей среды (199, Игла с антибиотиками) и помещают в термостат при 33°С.

Индикацию, типирование и дополнительные пассажи вирусов гриппа проводят как указано выше. Кроме того, инфицированные культуры 1 раз в день микроскопируют для оценки цитопатогенного действия вирусов.

Изоляцию аденовирусов, парагриппозных вирусов, РС-вируса, коронавирусов, вирусов герпеса и др. проводят на клеточных культурах (ПЭЧ, ЛЭЧ и Нер-2). Наиболее чувствительные культуры вносят по 0,2 мл материала от больного. Через 30-60 мин адсорбции вируса на клетках в культуры вносят по 0,8 мл поддерживающей среды Игла с антибиотиками (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина) и с 2% инактивированной фетальной сыворотки. Зараженные культуры инкубируют при температуре 36 °С до появления в них проявлений цитопатогенного действия (ЦПД).

Индикацию парагриппозных вирусов проводят по ЦПД и гемадсорбции с 0,4% взвесью эритроцитов морской свинки (20 мин при комнатной температуре), а остальных вирусов

- по характерному цитопатогенному действию.

Если при первичном заражении вирус не был выявлен ни в одном из тестов, материалы дополнительно пассируют еще 2 раза в тех же условиях.

Идентификацию вирусов ОРЗ проводят в чувствительных тканевых культурах с помощью реакции нейтрализации (РН) со специфическими иммунными сыворотками. Вируссодержащую культурную жидкость в дозе 100 ТИД50/0,2 мл в объеме 0,2 мл смешивают с 0,2 мл каждой из типоспецифических иммунных сывороток, взятых в разведении 1:20. Смесь вируса и сыворотки выдерживают 2 часа при комнатной температуре, после чего по 0,2 мл каждой смеси вносят в 2 пробирки с монослоем чувствительных клеток, а затем в пробирки добавляют по 0,8 мл поддерживающей среды. Инфицированные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре 36 °С. Параллельно типоспецифические сыворотки контролируют в отношении их активности к типовым эталонным штаммам.

Учет реакции проводят по ингибиции цитопатогенного действия (для аденовирусов, РС, простого герпеса), гемадсорбции (для парагриппозных вирусов) в день, когда типируемый вирус вызвал выраженное ЦПД клеток в контрольных культурах без сыворотки (при отсутствии дегенерации в контрольных посевах неинфицированных клеток и в контролях диагностических сывороток), в то время как эталонные штаммы полностью нейтрализованы типоспецифическими сыворотками. Тип выделенного штамма определяют по сыворотке, которая полностью предохранила клетки от дегенерации.

Методы быстрой диагностики основаны на обнаружении вирусных антигенов в материалах от больных с помощью специфических антител, маркированных флуорохромами и ферментами. Они широко используются в инфекционных стационарах для выяснения природы сходных по клиническим проявлениям, но отличных по этиологии, острых респираторных вирусных заболеваний в целях:

- раннего назначения специфических средств этиотропной терапии;

- прогнозирования тяжести развития заболеваний;

- рационального размещения больных по этиологическому принципу (во избежание перекрестного внутрибольничного инфицирования).

Методы ранней лабораторной диагностики используют также для быстрой расшифровки природы эпидемических вспышек в целях проведения соответствующих профилактических и лечебных мероприятий.

В последние годы в практике здравоохранения широкое распространение получил метод иммунофлуоресцентой диагностики гриппа и других ОРЗ. Наряду с ним внедряется и новый метод ранней диагностики гриппа, основанный на применении иммуноферментного анализа.

2.1. Метод иммунофлуоресцентной
диагностики гриппа и других ОРЗ (МИФ)

Прямой метод иммунофлуоресцентного анализа позволяет обнаружить вирусные антигены по их характерной локации непосредственно в клетках цилиндрического эпителия за счет взаимодействия антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченные флуоресцеинизотиоцианатом. По чувствительности МИФ не уступает другим методам лабораторной диагностики, однако, для правильной интерпретации результатов необходим определенный опыт работы. Тщательная микроскопия мазков требует значительного внимания и времени, что ограничивает возможности исследований и приносит элементы субъективизма в заключительный анализ.

К числу преимуществ метода относится возможность быстрого анализа небольшого числа проб (за 2-3 часа). Анализ наиболее эффективен в острой фазе (первые 3 дня) заболевания и существенно зависит от качества забора клинических материалов.

Используемые материалы: сухие тампоны из стерильной ваты, пробирки, марлевые салфетки, пинцет, обезжиренные предметные стекла, лейкопластырь, планшеты для предметных стекол, пастеровские пипетки, стеклянный сосуд для фиксации мазков, мерные пипетки, фильтровальная бумага, влажная камера для окраски препаратов, сосуд для промывания.

Растворы: 0,01 моль/л фосфатно-солевой буферный раствор (ФЕР) рН 7,4-7,5 (Na2HPO4.2H2O - 7,12 г, КН2РО4 - 1,38 г, NаСI - 42,5 г на 5 л дистиллированной воды), иммерсионное масло (диметилфталат).

Оборудование: люминесцентный микроскоп с масляным иммерсионным объективом, лабораторная центрифуга, термостат (+37°С), холодильник (+4°С), настольный вентилятор, ионометр, весы торсионные.

Для получения клинических материалов поочередно в обе полости носа больного на глубину 2-3 см вводят тампон легким движением по наружной стенке носа. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход, прижимают наружную стенку носа и вращательными движениями тщательно снимают десквамированный эпителий. Тампоны погружают в пробирку с 2 мл ФБР. Взятые материалы быстро (в течение 1-4 ч) доставляют в лабораторию.

Для получения осадка клеток цилиндрического эпителия пробирки с тампонами в ФБР энергично встряхивают, тампоны отживают и удаляют. Полученную суспензию клеток центрифугируют в течение 5-7 мин при 500-600 g. Надосадочную жидкость удаляют, осадок суспендируют пастеровской пипеткой в нескольких каплях остающейся на дне жидкости и используют для приготовления мазков, которые наносят на тщательно обезжиренные чистые предметные стекла (последние хранят до использования в этиловом 96° спирте). Стекла высушивают, маркируют, на каждое из них наносят по восемь капель осадка клеток и готовят мазки диаметром 6-7 мм, расположенные в шахматном порядке, которые высушивают при комнатной температуре под вентилятором. Затем мазки фиксируют, погружая стекла на 10 мин в химически чистый безводный ацетон, предварительно охлажденный до 2-4°С. Полученные препараты используют для окраски флуоресцирующими антителами (ФА).

Мазки от каждого больного окрашивают антителами к вирусам гриппа А (H1N1), А (H3N2), В, парагриппа 1, 2 и 3 типов, РС-вирусу и аденовирусам. С этой целью сухие препараты ФА регидратируют до исходного объема, указанного на этикетке, дистиллированной водой, выдерживают 5 мин при комнатной температуре до полного растворения препарата. После этого проводят центрифугирование конъюгатов (5-7 мин) при 6000 g, для окраски используют надосадочную жидкость. Восстановленный конъюгат фасуют по 0,1 мл и хранят при температуре не выше -10°С в течение 3-4 мес. Для проведения 160 анализов достаточно 1 мл конъюгата с рабочим разведением 1:8.

Техника окраски

Готовят рабочее разведение ФА на ФБР в соответствии с указанием на этикетке (срок хранения - не более 2 недель при +4°С). Предметные стакла с фиксированными мазкамипомещают во влажную камеру, на нижний мазок наносят каплю флуоресцирующего иммуноглобулина в рабочем разведении.

Стекла с мазками обрабатывают ФА в течение 30 мин при комнатной температуре (18-22°С) или в течение 20 мин при 37°С во влажной камере. Затем препараты вынимают, стряхивают с них капли ФА, споласкивают стекла в дистиллированной воде и помещают в сосуд с ФБР для промывания мазков (2 раза по 10-15 мин при комнатной температуре). Далее препараты споласкивают дистиллированной водой и высушивают в вертикальном положении при комнатной температуре под вентилятором.

Учет результатов

Мазки просматривают с масляной иммерсией, обращая внимание на число и тип клеток, уровень их свечения, наличие флуоресцирующих включений. В препаратах из носовой полости человека наиболее часто встречаются клетки цилиндрического эпителия, плоские эпителиальные клетки, лейкоциты. Диагностическое значение имеет выявление специфического свечения в клетках цилиндрического эпителия, имеющих бокаловидную форму или округлую форму с относительно крупным ядром и малой цитоплазматической зоной. Мелкие лейкоциты и крупные полигональные клетки с мелким ядром (плоского эпителия) при диагностике во внимание не принимаются. Следует учитывать результаты микроскопии только тех мазков, в которых содержится не менее 15 клеток цилиндрического эпителия. Интенсивность свечения клеток оценивают по общепринятой четырехкрестовой шкале. Свечение в клетках чаще всего локализуется в цитоплазме, хотя с ФА к гриппу и аденовирусам можно видеть специфическую флуоресценцию и в ядрах клеток. Диагностически доказательным является обнаружение не менее 3 клеток цилиндрического эпителия с отчетливо видимым зеленоватым специфическим свечением, яркость которого оценивается на один крест и более.

Используются для ранней дифференциальной диагностики гриппа типа А или В путем выделения вирусных антигенов в носоглоточных секретах (аспираты, смывы) от больных с симптомами ОРЗ. Преимуществом ИФА перед МИФ является его высокая чувствительность, возможность одновременного анализа большого числа клинических материалов, объективный количественный учет результатов.

Метод может быть использован для мониторинга инфекционного и вакционального процесса, для изучения острых и хронических форм вирусных инфекций, расшифровки природы эпидемических вспышек и индивидуальной диагностики.

Способ применения

Подготовка материала для исследования. Материалом для исследования служит отделяемое носовой полости у больных с симптомами ОРЗ, которое получают путем аспирации секретов с помощью устройства для забора жидкости, подсоединяемого к вакуумному насосу. Секреты перед исследованием разводят в 5 раз ФСБ с 0,05% твина-20. Допустимо использование носоглоточных смывов или мазков из области нижних носовых ходов, мягких соскобов с трахеи (в условиях специализированных клиник). В этом случае слизь и клеточное содержимое, снятые ватными тампонами, ресуспендируют в 2 мл ФСБ, содержащего 0,05% твина-20. Материалы от больных перед исследованием подвергают двукратному замораживанию-оттаиванию для высвобождения клеточных антигенов. Их можно хранить в течение 3-4 мес. при температуре от -15 до -25 °С.

Материалы и оборудование: планшеты для иммуноферментного анализа однократного применения, многоканальный спектрофотометр отечественного (АИФ-Ц-01С) или зарубежного производства (мультискан), регулируемые микропипетки одноканальные на 10-50 мкл и на 50-250 мкл, а также 8-канальные - на 50-250 мкл, устройство для забора жидкости однократного применения, электроотсос, ионометр, термостат, низкотемпературный прилавок, бытовой холодильник, иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов вирусов гриппа типа А или В (ИФТС "Грипп-виротест").

Состав ИФТС "Грипп-виротест":

1. Антитела к вирусу гриппа типа А (или В) - 1 амп.

2. Положительный контрольный образец вируса гриппа (К+) - 1 амп.

3. Отрицательный контрольный образец вируса гриппа гетерологичного типа), (К-) - 1 амп.

4. Антитела к вирусу гриппа, меченные пероксидазой хрена (Кон) - 1 амп.

5. Карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) - 1 фл.

6. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) - 1 фл.

7. Натрий хлористый - 1 фл.

8. Смесь желатина с сахарозой - 2 фл.

9. Твин - 20 - 1 фл.

10. Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1 фл.

11. Кислота лимонная - 1 фл.

12. Ортофенилендиамин - 1 фл.

13. Перекись водорода (3% раствор) - 1 фл.

14. Кислота серная (1 моль/л) - 1 фл.

15. Планшет для ИФА - 2 шт.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Содержимое флакона N5 (32 мг натрия углекислого и 58,4 мг натрия углекислого кислого) растворяют в 20 мл дистиллированной воды.

Раствор 2. 53 мг желатины и 750 мг сахарозы растворяют в 1 мл дистиллированной воды при температуре 55 °С. Содержимое 2-х флаконов (по 1,5 мл) объединяют.

Раствор 3. Содержимое флакона с ФСБ (712 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,136 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 4,25 г натрия хлористого) растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

Раствор 4. К 500 мл раствора 3 добавляют 250 мкл твина-20.

Раствор 5. К 320 мл раствора 4 добавляют 6,64 г натрия хлористого.

Раствор 6. К 18 мл раствора 4 добавляют 3 мл раствора 2.

Раствор 7. 0,216 г натрия фосфорнокислого двузамещенного растворяют в 6 мл дистиллированной воды (раствор В). Смешивают 5,1 раствора А и 4,9 мл раствора В, объем доводят до 20 мл дистиллированной водой (ЦФБ).

Раствор 8. 20 мг ортофенилендиамина растворяют в 20 мл раствора 7, добавляют 0,2 мл 3% раствора перекиси водорода (раствор 8 готовят непосредственно перед употреблением).

Раствор 9. Содержимое ампулы с антителами растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Затем препарат антител разводят с помощью раствора 1 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Раствор 10. Содержимое ампулы с антителами, меченными пероксидазой, растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат конъюгата (Кон) доводят с помощью раствора 6 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Раствор 11. Содержимое ампулы с К+ растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат К+ разводят с помощью раствора 4 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Раствор 12. Содержимое ампулы с К- растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат К- разводят с помощью раствора 4 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Примечание: иммунореагенты тест-системы после растворения хранить при температуре 4-8 °С не более 15 сут.

Проведение ИФА:

1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антител к вирусу гриппа в рабочем разведении.

2. Планшет закрывают крышкой и выдерживают при температуре 4-8 °С в течение (18+-2) ч.

3. По завершении адсорбции антител жидкость из лунок удаляют встряхиванием перевернутого планшета и постукиванием по фильтровальной бумаге. Лунки планшета при комнатной температуре промывают 3 раза по 0,2 мл раствора 4 и 1 раз - дистиллированной водой. Планшет осушают.

4. В 8 краевых лунок первого ряда вносят по 100 мл раствора 4.

5. Рабочие растворы К+ и К- вносят по 100 мл в лунки второго ряда (по 2 лунки на каждый).

6. Исследуемые материалы от больных вносят по 100 мкл (в 2 лунки каждый).

7. Планшеты закрывают и выдерживают при температуре 4-6 °С в течение 18 ч.

8. Содержимое лунок удаляют, планшеты промывают 4 раза раствором 5 и 1 раз - дистиллированной водой.

9. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл Кон в рабочем разведении.

10. Планшеты закрывают и инкубируют 2 ч при температуре (20+-3)°С в течение 2 ч.

11. Планшеты промывают как указано в п.8.

12. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора 8.

13. Планшеты инкубируют 4-5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте (до появления желтого окрашивания в лунках с К+).

14. Реакцию останавливают внесением в лунки по 50 мкл раствора серной кислоты.

Учет результатов

Результаты учитывают с помощью спектрофотометра (мультискана) зарубежного или отечественного производства (типа АИФ-Ц-01С) при длине волны 490 нм. По показаниям прибора рассчитывают среднюю величину оптической плотности (ОП490) раствора в контрольных лунках первого ряда (Мк). Значение Мк должно быть не выше, чем 0,07. Средняя величина ОП490 растворов в двух лунках с положительными контрольными образцами (М+) должна быть не ниже, чем 0,35, а отклонения значений ОП490 в дубликатах проб с К+ от М+ - не более 20%. Значения ОП490 раствора в лунках с Кдолжны быть не выше, чем 0,1.

К числу положительных (содержащих вирус гриппа соответствующего типа) относят те из исследуемых проб, значения ОП490 по которым превышают значения Мк не менее, чем в 1,6 раза.

Предосторожности в работе

При работе с вируссодержащими материалами от больных все операции следует выполнять в масках, не допускается пипетирование ртом, все использованные материалы следует подвергать обработке хлорамином (3% раствор) в течение 18 ч. Необходимо избегать попадания раствора ортофенилендиамина на кожу и слизистые, в случае контакта - промыть большим количеством воды.

Серологические реакции, такие как реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), используются для определения уровня специфических антител в сыворотках больных ОРЗ с целью ретроспективного подтверждения диагноза. Эти методы используются также для определения уровня коллективного гуморального иммунитета, ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек, оценки иммуногенной активности гриппозных вакцин.

3.1. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
для диагностики гриппа и парагриппозной инфекции

Метод основан на подавлении гемагглютинирующей активности вируса в присутствии специфических антител.

Для проведения РТГА с гриппозными антителами используют диагностикумы из штаммов, резистентных к неспецифическим сывороточным ингибиторам. Перед постановкой реакции парные сыворотки крови от больных, взятые в острой фазе инфекции и в период реконвалесценции, разводят в 10 раз физиологическим раствором (ФР) и прогревают в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. При постановке РТГА с парагриппозными антигенами сыворотки необходимо дополнительно освобождать от неспецифических гемагглютининов. Для этого к сывороткам, разведенным в 10 раз, добавляют по 1 капле осадка эритроцитов морской свинки, смесь встряхивают и оставляют на ночь при температуре +4 °С. В работе используют надосадочную жидкость.

При проведении РТГА с вирусами гриппа используют эритроциты кур или человека 0(1) группы крови, с вирусами парагриппа - эритроциты морской свинки. Для получения эритроцитов морской свинки используют 2,5% раствор лимоннокислого натрия на ФР, который добавляют к цельной крови в соотношении 1:5, эритроцитов кур - раствор Альсевера (1:1), состоящий из глюкозы (2,05 г), хлористого натрия (0,42 г) и лимоннокислого натрия (0,8 г), разведенных в 100 мл дистиллированной воды. Эритроциты хранят при +4 °С до появления первых признаков гемолиза (в течение 1 недели). Перед постановкой опыта эритроциты кур и морских свинок отмывают ФР три раза, человека - 6 раз с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 15 мин. В реакции используют 1% суспензию эритроцитов.

В РТГА используют раствор антигена, содержащий 4 ГЕ/0,1 мл.

Предварительно в реакции гемагглютинации (РГА) определяют титр антигена. Для этого вряду лунок планшета, содержащих по 0,1 мл ФР, готовят двукратные разведения антигена (начиная с 1:2 до титра, указанного на этикетке). После этого в каждую лунку вносят дополнительно по 0,1 мл ФР и 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Для контроля оседания эритроцитов в отсутствие антигена в дополнительном ряду смешивают по 0,2 мл ФР и 0,2 мл эритроцитов. Через 45-60 мин инкубации при температуре 20+-5°С при полном оседании эритроцитов в контрольном ряду учитывают результаты реакции.

Титром антигена считают его последнее разведение, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов.

Кратность разведения антигена для получения заданной дозы вируса определяют как частное от деления титра антигена на 4. В полученном растворе определяют правильность выбранной дозы повторным титрованием антигена с доведением ее (при несоответствии) до 4 ГЕ добавлением ФР или вирусного антигена. Дополнительно дозу вируса уточняют по результатам его взаимодействия со стандартной иммунной референс-сывороткой, которая должна в повторных опытах нейтрализовать 4 ГЕ в одном и том же разведении.

Парные сыворотки от больного исследуют в одном опыте. Готовят серию двукратных разведений сывороток на ФР (от 1:10 до 1:320) в объеме 0,1 мл. К каждому разведению добавляют по 0,1 мл (4 ГЕ) вируса. Панели встряхивают и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Результаты реакции учитывают после оседания эритроцитов в контрольных лунках (без вируса). Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, в котором наблюдается полное ингибирование гемагглютинации вируса. Диагностически достоверным считается не менее, чем 4-кратное увеличение титров антител в постинфекционной сыворотке по сравнению с сывороткой острой фазы заболевания.

Использование иммуноферментного метода индикации антител к возбудителям острых респираторных вирусных инфекций обеспечивает ряд преимуществ перед традиционными тестами.

К ним относятся:

- высокая чувствительность тестов (титры выявляемых антител в сотни раз превышают регистрируемые в РТГА и РСК);

- специфичность анализа (на результат реакции не влияет присутствие неспецифических ингибиторов сывороток);

- повышенная (на 10-40%) частота распознавания вирусных ОРЗ при гриппе А, аденовирусной и РС-вирусной инфекциях;

- возможность дифференцированной индикации специфических антител классов IgG и IgM и распознавании тем самым острой фазы заболеваний, например, при внутрибольничных инфекциях, при вспышках ОРЗ и др.;

- возможность использования микроколичества сыворотки (1 мкл) для проведения анализа;

- отсутствие необходимости в трудоемких операциях по титрованию антител (при количественной индикации результатов реакции на мультискане).

Для проведения иммуноферментного анализа используют тест-системы, разработанные и выпускаемые НИИ гриппа РАМН.

Состав набора:

Приготовление растворов

1. ФСБ

Для получения 0,5 л ФСБ содержимое флакона N 9 растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

2. Промывающий раствор (ПР)

Для получения ПР к 500 мл ФСБ добавляют 0,25 мл твина-20.

3. Раствор для разведения К-, К+, конъюгата и исследуемых сывороток (РРК)

Для получения РРК во все флаконы с желатиновой смесью добавляют по 4,0 мл подогретой (50-55 °С) дистиллированной воды, содержимое флаконов объединяют, к смеси добавляют 40 мл ПР.

4. КББ

Для получения раствора КББ содержимое флакона N 8 растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

5. К+, К- и исследуемые сыворотки

В ампулы с К+ и К- добавляют дистиллированную воду по 0,1 мл и разводят как указано на этикетке. Исследуемые сыворотки разводят 1:400 и 1:800 на РКК.

6. ОФД. Готовят непосредственно перед употреблением.

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного двуводного (флакон N 12) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор А). Навеску лимонной кислоты (флакон N 13) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор В). Смешивают 2,5 мл раствора А и 2,5 мл раствора В, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой (цитратно-фосфатный буфер (ЦФБ) рН 5,0+-0,1). Навеску ОФД (флакон N 6) растворить в 10 мл ЦФБ, добавить 0,1 мл 3%-ного раствора перекиси водорода (флакон N 7), перемешать.

7. Конъюгат. Рабочее разведение.

Содержимое ампулы (0,01 мл) растворяют в РКК до титра, указанного на этикетке.

8. Антигены. Антигены регидрируют дистиллированной водой до первоначального объема (0,1 мл), затем добавляют 10 мл КББ.

Проведение иммуноферментного анализа

1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антигена. Планшет накрывают крышкой, инкубируют 18 ч при (4-6) °С.

2. По окончании инкубации раствор антигена удаляют, планшеты промывают 3 раза ПР.

3. В лунки планшета А1, В1 вносят по 100 мкл раствора К+, в лунки С1, D1 - по 100 мкл раствора К-, в лунки Е1, F1, G1, H1 - по 100 мкл ФСБ. В остальные лунки планшета вносят по 100 мкл исследуемых сывороток, разведенных каждая 1:400 и 1:800 на РКК.

4. Планшеты накрывают крышкой и инкубируют 2 ч при 37 °С.

5. По окончании инкубации планшеты освобождают от содержимого, промывают 4 раза ПР.

6. Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата.

7. Инкубируют планшеты в закрытом виде 45 мин при 37 °С.

8. Удаляют содержимое лунок, планшеты промывают 4 раза ПР.

9. Во все лунки вносят по 100 мл раствора ОФБ.

10. Инкубируют 10-20 мин при температуре 20-25 °С в темном месте.

11. Для остановки реакции в каждую лунку добавляют по 50 мкл серной кислоты (флакон N 14).

Учет и интерпретация результатов

Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Установку "бланк" спектрофотометра осуществляют по лункам С1-Н1 каждого планшета. Оценку результатов исследования производят только в том случае, если средний показатель оптической плотности (ОП490) в К+ выше, чем в К-, не менее, чем на 0,5 ед. ОП490. Увеличение ОП490 на 0,3 ед. и более в сыворотке реконвалесцента по сравнению с сывороткой в том же разведении, полученной в острой фазе заболевания, расценивается как диагностически достоверное.

Адрес изготовителя: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17 НИИ гриппа; тел. 234-12-10, 234-58-75, 234-15-48 факс (812) 234-01-50

Начальник Управления
профилактической медицины
Минздравмедпрома России
Р.И.ХАЛИТОВ

Начальник Управления Государственного
санитарно-эпидемиологического надзора
и экспертизы Госкомсанэпиднадзора
России
В.И.ЧИБУРАЕВ

Приложение 5
к приказу Минздравмедпрома
и Госкомсанэпиднадзора РФ
от 19 апреля 1995 г. N 101/46