Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздравмедпрома РФ N 101, Госкомсанэпиднадзора РФ N 46 от 19.04.95 "О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ ОТ ГРИППА И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

1.1. Изоляция и идентификация вирусов

Для выделения вирусов гриппа исследуемые материалы после их первичной обработки вводят по 0,1 мл в амниотическую полость и по 0,2 мл в аллантоисную полость 10-дневных куриных эмбрионов.

Заражение проводят в затемненном боксе через боковую поверхность скорлупы, направляя иглу сначала в амниотическую, а затем в аллантоисную полости, предварительно сделав дополнительный прокол в скорлупе над воздушной камерой. Материалом от одного больного заражают 3 эмбриона.

Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате 72 часа при 33-34°С. После инкубации эмбрионы помещают на ночь в рефрижератор при 4°С.

Индикацию вируса гриппа осуществляют в реакции гемагглютинации (РГА) путем добавления 0,5 мл 1% суспензии отмытых эритроцитов кур к 0,5 мл вируссодержащего материала. Результаты РГА учитывают после 30-минутного оседания эритроцитов в лунках панелей при комнатной температуре.

При отсутствии агглютинации эритроцитов необходимо провести 3 дополнительных пассажа путем заражения эмбрионов смесью амниотической и аллантоисной жидкостей от предыдущего пассажа. В случае отрицательных результатов РГА после 3-х пассажей исследование материалов прекращают.

Идентификацию вирусов гриппа проводят в РТГА.

Для этого к 0,2 мл последовательных разведений типоспецифических иммунных сывороток добавляют по 0,2 мл рабочей дозы вируса в количестве 4 гемагглютинирующих единиц (ГЕ). Одной ГЕ считают последнее разведение вируса, дающее отчетливую гемагглютинацию. После 1-часового контакта сыворотки с вирусом при комнатной температуре в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1% взвести куриных эритроцитов. Титром сывороток считают ее последнее разведение, блокирующее 4 ГЕ вируса.

Типовую принадлежность вируса определяют по ингибиции гемагглютинации, которая должна быть зарегистрирована в разведении не менее, чем 1:20.

Выделение вирусов гриппа может быть осуществлено на чувствительных культурах клеток, чаще всего МДСК. Для этого в пробирки монослоем, отмытым физиологическим фосфатным буфером или раствором Хэнкса, вносят по 0,2 мл материала от больного. Через 1 ч адсорбции при 38 °С в культуры добавляют по 1,5 мл поддерживающей среды (199, Игла с антибиотиками) и помещают в термостат при 33°С.

Индикацию, типирование и дополнительные пассажи вирусов гриппа проводят как указано выше. Кроме того, инфицированные культуры 1 раз в день микроскопируют для оценки цитопатогенного действия вирусов.