Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздравмедпрома РФ N 101, Госкомсанэпиднадзора РФ N 46 от 19.04.95 "О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ ОТ ГРИППА И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

Серологические реакции, такие как реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), используются для определения уровня специфических антител в сыворотках больных ОРЗ с целью ретроспективного подтверждения диагноза. Эти методы используются также для определения уровня коллективного гуморального иммунитета, ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек, оценки иммуногенной активности гриппозных вакцин.

3.1. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
для диагностики гриппа и парагриппозной инфекции

Метод основан на подавлении гемагглютинирующей активности вируса в присутствии специфических антител.

Для проведения РТГА с гриппозными антителами используют диагностикумы из штаммов, резистентных к неспецифическим сывороточным ингибиторам. Перед постановкой реакции парные сыворотки крови от больных, взятые в острой фазе инфекции и в период реконвалесценции, разводят в 10 раз физиологическим раствором (ФР) и прогревают в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. При постановке РТГА с парагриппозными антигенами сыворотки необходимо дополнительно освобождать от неспецифических гемагглютининов. Для этого к сывороткам, разведенным в 10 раз, добавляют по 1 капле осадка эритроцитов морской свинки, смесь встряхивают и оставляют на ночь при температуре +4 °С. В работе используют надосадочную жидкость.

При проведении РТГА с вирусами гриппа используют эритроциты кур или человека 0(1) группы крови, с вирусами парагриппа - эритроциты морской свинки. Для получения эритроцитов морской свинки используют 2,5% раствор лимоннокислого натрия на ФР, который добавляют к цельной крови в соотношении 1:5, эритроцитов кур - раствор Альсевера (1:1), состоящий из глюкозы (2,05 г), хлористого натрия (0,42 г) и лимоннокислого натрия (0,8 г), разведенных в 100 мл дистиллированной воды. Эритроциты хранят при +4 °С до появления первых признаков гемолиза (в течение 1 недели). Перед постановкой опыта эритроциты кур и морских свинок отмывают ФР три раза, человека - 6 раз с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 15 мин. В реакции используют 1% суспензию эритроцитов.

В РТГА используют раствор антигена, содержащий 4 ГЕ/0,1 мл.

Предварительно в реакции гемагглютинации (РГА) определяют титр антигена. Для этого вряду лунок планшета, содержащих по 0,1 мл ФР, готовят двукратные разведения антигена (начиная с 1:2 до титра, указанного на этикетке). После этого в каждую лунку вносят дополнительно по 0,1 мл ФР и 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Для контроля оседания эритроцитов в отсутствие антигена в дополнительном ряду смешивают по 0,2 мл ФР и 0,2 мл эритроцитов. Через 45-60 мин инкубации при температуре 20+-5°С при полном оседании эритроцитов в контрольном ряду учитывают результаты реакции.

Титром антигена считают его последнее разведение, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов.

Кратность разведения антигена для получения заданной дозы вируса определяют как частное от деления титра антигена на 4. В полученном растворе определяют правильность выбранной дозы повторным титрованием антигена с доведением ее (при несоответствии) до 4 ГЕ добавлением ФР или вирусного антигена. Дополнительно дозу вируса уточняют по результатам его взаимодействия со стандартной иммунной референс-сывороткой, которая должна в повторных опытах нейтрализовать 4 ГЕ в одном и том же разведении.

Парные сыворотки от больного исследуют в одном опыте. Готовят серию двукратных разведений сывороток на ФР (от 1:10 до 1:320) в объеме 0,1 мл. К каждому разведению добавляют по 0,1 мл (4 ГЕ) вируса. Панели встряхивают и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Результаты реакции учитывают после оседания эритроцитов в контрольных лунках (без вируса). Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, в котором наблюдается полное ингибирование гемагглютинации вируса. Диагностически достоверным считается не менее, чем 4-кратное увеличение титров антител в постинфекционной сыворотке по сравнению с сывороткой острой фазы заболевания.

Использование иммуноферментного метода индикации антител к возбудителям острых респираторных вирусных инфекций обеспечивает ряд преимуществ перед традиционными тестами.

К ним относятся:

- высокая чувствительность тестов (титры выявляемых антител в сотни раз превышают регистрируемые в РТГА и РСК);

- специфичность анализа (на результат реакции не влияет присутствие неспецифических ингибиторов сывороток);

- повышенная (на 10-40%) частота распознавания вирусных ОРЗ при гриппе А, аденовирусной и РС-вирусной инфекциях;

- возможность дифференцированной индикации специфических антител классов IgG и IgM и распознавании тем самым острой фазы заболеваний, например, при внутрибольничных инфекциях, при вспышках ОРЗ и др.;

- возможность использования микроколичества сыворотки (1 мкл) для проведения анализа;

- отсутствие необходимости в трудоемких операциях по титрованию антител (при количественной индикации результатов реакции на мультискане).

Для проведения иммуноферментного анализа используют тест-системы, разработанные и выпускаемые НИИ гриппа РАМН.

Состав набора:

Приготовление растворов

1. ФСБ

Для получения 0,5 л ФСБ содержимое флакона N 9 растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

2. Промывающий раствор (ПР)

Для получения ПР к 500 мл ФСБ добавляют 0,25 мл твина-20.

3. Раствор для разведения К-, К+, конъюгата и исследуемых сывороток (РРК)

Для получения РРК во все флаконы с желатиновой смесью добавляют по 4,0 мл подогретой (50-55 °С) дистиллированной воды, содержимое флаконов объединяют, к смеси добавляют 40 мл ПР.

4. КББ

Для получения раствора КББ содержимое флакона N 8 растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

5. К+, К- и исследуемые сыворотки

В ампулы с К+ и К- добавляют дистиллированную воду по 0,1 мл и разводят как указано на этикетке. Исследуемые сыворотки разводят 1:400 и 1:800 на РКК.

6. ОФД. Готовят непосредственно перед употреблением.

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного двуводного (флакон N 12) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор А). Навеску лимонной кислоты (флакон N 13) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор В). Смешивают 2,5 мл раствора А и 2,5 мл раствора В, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой (цитратно-фосфатный буфер (ЦФБ) рН 5,0+-0,1). Навеску ОФД (флакон N 6) растворить в 10 мл ЦФБ, добавить 0,1 мл 3%-ного раствора перекиси водорода (флакон N 7), перемешать.

7. Конъюгат. Рабочее разведение.

Содержимое ампулы (0,01 мл) растворяют в РКК до титра, указанного на этикетке.

8. Антигены. Антигены регидрируют дистиллированной водой до первоначального объема (0,1 мл), затем добавляют 10 мл КББ.

Проведение иммуноферментного анализа

1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антигена. Планшет накрывают крышкой, инкубируют 18 ч при (4-6) °С.

2. По окончании инкубации раствор антигена удаляют, планшеты промывают 3 раза ПР.

3. В лунки планшета А1, В1 вносят по 100 мкл раствора К+, в лунки С1, D1 - по 100 мкл раствора К-, в лунки Е1, F1, G1, H1 - по 100 мкл ФСБ. В остальные лунки планшета вносят по 100 мкл исследуемых сывороток, разведенных каждая 1:400 и 1:800 на РКК.

4. Планшеты накрывают крышкой и инкубируют 2 ч при 37 °С.

5. По окончании инкубации планшеты освобождают от содержимого, промывают 4 раза ПР.

6. Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата.

7. Инкубируют планшеты в закрытом виде 45 мин при 37 °С.

8. Удаляют содержимое лунок, планшеты промывают 4 раза ПР.

9. Во все лунки вносят по 100 мл раствора ОФБ.

10. Инкубируют 10-20 мин при температуре 20-25 °С в темном месте.

11. Для остановки реакции в каждую лунку добавляют по 50 мкл серной кислоты (флакон N 14).

Учет и интерпретация результатов

Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Установку "бланк" спектрофотометра осуществляют по лункам С1-Н1 каждого планшета. Оценку результатов исследования производят только в том случае, если средний показатель оптической плотности (ОП490) в К+ выше, чем в К-, не менее, чем на 0,5 ед. ОП490. Увеличение ОП490 на 0,3 ед. и более в сыворотке реконвалесцента по сравнению с сывороткой в том же разведении, полученной в острой фазе заболевания, расценивается как диагностически достоверное.

Адрес изготовителя: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17 НИИ гриппа; тел. 234-12-10, 234-58-75, 234-15-48 факс (812) 234-01-50

Начальник Управления
профилактической медицины
Минздравмедпрома России
Р.И.ХАЛИТОВ

Начальник Управления Государственного
санитарно-эпидемиологического надзора
и экспертизы Госкомсанэпиднадзора
России
В.И.ЧИБУРАЕВ

Приложение 5
к приказу Минздравмедпрома
и Госкомсанэпиднадзора РФ
от 19 апреля 1995 г. N 101/46