Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздравмедпрома РФ N 101, Госкомсанэпиднадзора РФ N 46 от 19.04.95 "О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ ОТ ГРИППА И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

Используются для ранней дифференциальной диагностики гриппа типа А или В путем выделения вирусных антигенов в носоглоточных секретах (аспираты, смывы) от больных с симптомами ОРЗ. Преимуществом ИФА перед МИФ является его высокая чувствительность, возможность одновременного анализа большого числа клинических материалов, объективный количественный учет результатов.

Метод может быть использован для мониторинга инфекционного и вакционального процесса, для изучения острых и хронических форм вирусных инфекций, расшифровки природы эпидемических вспышек и индивидуальной диагностики.

Способ применения

Подготовка материала для исследования. Материалом для исследования служит отделяемое носовой полости у больных с симптомами ОРЗ, которое получают путем аспирации секретов с помощью устройства для забора жидкости, подсоединяемого к вакуумному насосу. Секреты перед исследованием разводят в 5 раз ФСБ с 0,05% твина-20. Допустимо использование носоглоточных смывов или мазков из области нижних носовых ходов, мягких соскобов с трахеи (в условиях специализированных клиник). В этом случае слизь и клеточное содержимое, снятые ватными тампонами, ресуспендируют в 2 мл ФСБ, содержащего 0,05% твина-20. Материалы от больных перед исследованием подвергают двукратному замораживанию-оттаиванию для высвобождения клеточных антигенов. Их можно хранить в течение 3-4 мес. при температуре от -15 до -25 °С.

Материалы и оборудование: планшеты для иммуноферментного анализа однократного применения, многоканальный спектрофотометр отечественного (АИФ-Ц-01С) или зарубежного производства (мультискан), регулируемые микропипетки одноканальные на 10-50 мкл и на 50-250 мкл, а также 8-канальные - на 50-250 мкл, устройство для забора жидкости однократного применения, электроотсос, ионометр, термостат, низкотемпературный прилавок, бытовой холодильник, иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов вирусов гриппа типа А или В (ИФТС "Грипп-виротест").

Состав ИФТС "Грипп-виротест":

1. Антитела к вирусу гриппа типа А (или В) - 1 амп.

2. Положительный контрольный образец вируса гриппа (К+) - 1 амп.

3. Отрицательный контрольный образец вируса гриппа гетерологичного типа), (К-) - 1 амп.

4. Антитела к вирусу гриппа, меченные пероксидазой хрена (Кон) - 1 амп.

5. Карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) - 1 фл.

6. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) - 1 фл.

7. Натрий хлористый - 1 фл.

8. Смесь желатина с сахарозой - 2 фл.

9. Твин - 20 - 1 фл.

10. Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1 фл.

11. Кислота лимонная - 1 фл.

12. Ортофенилендиамин - 1 фл.

13. Перекись водорода (3% раствор) - 1 фл.

14. Кислота серная (1 моль/л) - 1 фл.

15. Планшет для ИФА - 2 шт.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Содержимое флакона N5 (32 мг натрия углекислого и 58,4 мг натрия углекислого кислого) растворяют в 20 мл дистиллированной воды.

Раствор 2. 53 мг желатины и 750 мг сахарозы растворяют в 1 мл дистиллированной воды при температуре 55 °С. Содержимое 2-х флаконов (по 1,5 мл) объединяют.

Раствор 3. Содержимое флакона с ФСБ (712 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,136 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 4,25 г натрия хлористого) растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

Раствор 4. К 500 мл раствора 3 добавляют 250 мкл твина-20.

Раствор 5. К 320 мл раствора 4 добавляют 6,64 г натрия хлористого.

Раствор 6. К 18 мл раствора 4 добавляют 3 мл раствора 2.

Раствор 7. 0,216 г натрия фосфорнокислого двузамещенного растворяют в 6 мл дистиллированной воды (раствор В). Смешивают 5,1 раствора А и 4,9 мл раствора В, объем доводят до 20 мл дистиллированной водой (ЦФБ).

Раствор 8. 20 мг ортофенилендиамина растворяют в 20 мл раствора 7, добавляют 0,2 мл 3% раствора перекиси водорода (раствор 8 готовят непосредственно перед употреблением).

Раствор 9. Содержимое ампулы с антителами растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Затем препарат антител разводят с помощью раствора 1 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Раствор 10. Содержимое ампулы с антителами, меченными пероксидазой, растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат конъюгата (Кон) доводят с помощью раствора 6 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Раствор 11. Содержимое ампулы с К+ растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат К+ разводят с помощью раствора 4 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Раствор 12. Содержимое ампулы с К- растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат К- разводят с помощью раствора 4 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).

Примечание: иммунореагенты тест-системы после растворения хранить при температуре 4-8 °С не более 15 сут.

Проведение ИФА:

1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антител к вирусу гриппа в рабочем разведении.

2. Планшет закрывают крышкой и выдерживают при температуре 4-8 °С в течение (18+-2) ч.

3. По завершении адсорбции антител жидкость из лунок удаляют встряхиванием перевернутого планшета и постукиванием по фильтровальной бумаге. Лунки планшета при комнатной температуре промывают 3 раза по 0,2 мл раствора 4 и 1 раз - дистиллированной водой. Планшет осушают.

4. В 8 краевых лунок первого ряда вносят по 100 мл раствора 4.

5. Рабочие растворы К+ и К- вносят по 100 мл в лунки второго ряда (по 2 лунки на каждый).

6. Исследуемые материалы от больных вносят по 100 мкл (в 2 лунки каждый).

7. Планшеты закрывают и выдерживают при температуре 4-6 °С в течение 18 ч.

8. Содержимое лунок удаляют, планшеты промывают 4 раза раствором 5 и 1 раз - дистиллированной водой.

9. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл Кон в рабочем разведении.

10. Планшеты закрывают и инкубируют 2 ч при температуре (20+-3)°С в течение 2 ч.

11. Планшеты промывают как указано в п.8.

12. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора 8.

13. Планшеты инкубируют 4-5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте (до появления желтого окрашивания в лунках с К+).

14. Реакцию останавливают внесением в лунки по 50 мкл раствора серной кислоты.

Учет результатов

Результаты учитывают с помощью спектрофотометра (мультискана) зарубежного или отечественного производства (типа АИФ-Ц-01С) при длине волны 490 нм. По показаниям прибора рассчитывают среднюю величину оптической плотности (ОП490) раствора в контрольных лунках первого ряда (Мк). Значение Мк должно быть не выше, чем 0,07. Средняя величина ОП490 растворов в двух лунках с положительными контрольными образцами (М+) должна быть не ниже, чем 0,35, а отклонения значений ОП490 в дубликатах проб с К+ от М+ - не более 20%. Значения ОП490 раствора в лунках с Кдолжны быть не выше, чем 0,1.

К числу положительных (содержащих вирус гриппа соответствующего типа) относят те из исследуемых проб, значения ОП490 по которым превышают значения Мк не менее, чем в 1,6 раза.

Предосторожности в работе

При работе с вируссодержащими материалами от больных все операции следует выполнять в масках, не допускается пипетирование ртом, все использованные материалы следует подвергать обработке хлорамином (3% раствор) в течение 18 ч. Необходимо избегать попадания раствора ортофенилендиамина на кожу и слизистые, в случае контакта - промыть большим количеством воды.