Законодательная база Российской Федерации

ПРИКАЗ Минздравмедпрома РФ N 101, Госкомсанэпиднадзора РФ N 46 от 19.04.95 "О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ ОТ ГРИППА И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

2.1. Метод иммунофлуоресцентной
диагностики гриппа и других ОРЗ (МИФ)

Прямой метод иммунофлуоресцентного анализа позволяет обнаружить вирусные антигены по их характерной локации непосредственно в клетках цилиндрического эпителия за счет взаимодействия антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченные флуоресцеинизотиоцианатом. По чувствительности МИФ не уступает другим методам лабораторной диагностики, однако, для правильной интерпретации результатов необходим определенный опыт работы. Тщательная микроскопия мазков требует значительного внимания и времени, что ограничивает возможности исследований и приносит элементы субъективизма в заключительный анализ.

К числу преимуществ метода относится возможность быстрого анализа небольшого числа проб (за 2-3 часа). Анализ наиболее эффективен в острой фазе (первые 3 дня) заболевания и существенно зависит от качества забора клинических материалов.

Используемые материалы: сухие тампоны из стерильной ваты, пробирки, марлевые салфетки, пинцет, обезжиренные предметные стекла, лейкопластырь, планшеты для предметных стекол, пастеровские пипетки, стеклянный сосуд для фиксации мазков, мерные пипетки, фильтровальная бумага, влажная камера для окраски препаратов, сосуд для промывания.

Растворы: 0,01 моль/л фосфатно-солевой буферный раствор (ФЕР) рН 7,4-7,5 (Na2HPO4.2H2O - 7,12 г, КН2РО4 - 1,38 г, NаСI - 42,5 г на 5 л дистиллированной воды), иммерсионное масло (диметилфталат).

Оборудование: люминесцентный микроскоп с масляным иммерсионным объективом, лабораторная центрифуга, термостат (+37°С), холодильник (+4°С), настольный вентилятор, ионометр, весы торсионные.

Для получения клинических материалов поочередно в обе полости носа больного на глубину 2-3 см вводят тампон легким движением по наружной стенке носа. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход, прижимают наружную стенку носа и вращательными движениями тщательно снимают десквамированный эпителий. Тампоны погружают в пробирку с 2 мл ФБР. Взятые материалы быстро (в течение 1-4 ч) доставляют в лабораторию.

Для получения осадка клеток цилиндрического эпителия пробирки с тампонами в ФБР энергично встряхивают, тампоны отживают и удаляют. Полученную суспензию клеток центрифугируют в течение 5-7 мин при 500-600 g. Надосадочную жидкость удаляют, осадок суспендируют пастеровской пипеткой в нескольких каплях остающейся на дне жидкости и используют для приготовления мазков, которые наносят на тщательно обезжиренные чистые предметные стекла (последние хранят до использования в этиловом 96° спирте). Стекла высушивают, маркируют, на каждое из них наносят по восемь капель осадка клеток и готовят мазки диаметром 6-7 мм, расположенные в шахматном порядке, которые высушивают при комнатной температуре под вентилятором. Затем мазки фиксируют, погружая стекла на 10 мин в химически чистый безводный ацетон, предварительно охлажденный до 2-4°С. Полученные препараты используют для окраски флуоресцирующими антителами (ФА).

Мазки от каждого больного окрашивают антителами к вирусам гриппа А (H1N1), А (H3N2), В, парагриппа 1, 2 и 3 типов, РС-вирусу и аденовирусам. С этой целью сухие препараты ФА регидратируют до исходного объема, указанного на этикетке, дистиллированной водой, выдерживают 5 мин при комнатной температуре до полного растворения препарата. После этого проводят центрифугирование конъюгатов (5-7 мин) при 6000 g, для окраски используют надосадочную жидкость. Восстановленный конъюгат фасуют по 0,1 мл и хранят при температуре не выше -10°С в течение 3-4 мес. Для проведения 160 анализов достаточно 1 мл конъюгата с рабочим разведением 1:8.

Техника окраски

Готовят рабочее разведение ФА на ФБР в соответствии с указанием на этикетке (срок хранения - не более 2 недель при +4°С). Предметные стакла с фиксированными мазкамипомещают во влажную камеру, на нижний мазок наносят каплю флуоресцирующего иммуноглобулина в рабочем разведении.

Стекла с мазками обрабатывают ФА в течение 30 мин при комнатной температуре (18-22°С) или в течение 20 мин при 37°С во влажной камере. Затем препараты вынимают, стряхивают с них капли ФА, споласкивают стекла в дистиллированной воде и помещают в сосуд с ФБР для промывания мазков (2 раза по 10-15 мин при комнатной температуре). Далее препараты споласкивают дистиллированной водой и высушивают в вертикальном положении при комнатной температуре под вентилятором.

Учет результатов

Мазки просматривают с масляной иммерсией, обращая внимание на число и тип клеток, уровень их свечения, наличие флуоресцирующих включений. В препаратах из носовой полости человека наиболее часто встречаются клетки цилиндрического эпителия, плоские эпителиальные клетки, лейкоциты. Диагностическое значение имеет выявление специфического свечения в клетках цилиндрического эпителия, имеющих бокаловидную форму или округлую форму с относительно крупным ядром и малой цитоплазматической зоной. Мелкие лейкоциты и крупные полигональные клетки с мелким ядром (плоского эпителия) при диагностике во внимание не принимаются. Следует учитывать результаты микроскопии только тех мазков, в которых содержится не менее 15 клеток цилиндрического эпителия. Интенсивность свечения клеток оценивают по общепринятой четырехкрестовой шкале. Свечение в клетках чаще всего локализуется в цитоплазме, хотя с ФА к гриппу и аденовирусам можно видеть специфическую флуоресценцию и в ядрах клеток. Диагностически доказательным является обнаружение не менее 3 клеток цилиндрического эпителия с отчетливо видимым зеленоватым специфическим свечением, яркость которого оценивается на один крест и более.